羧甲基纖維素鈉對(duì)綠豆分離蛋白乳液穩(wěn)定性的影響

任思，劉麗婭，龐淑婕，李娜娜，周素梅，王立*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京，100193)

隨著人們對(duì)豆類(lèi)蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的提高，豆類(lèi)蛋白的需求量激增，大豆蛋白和豌豆蛋白受到廣泛關(guān)注[1-2]。綠豆蛋白是綠豆中除淀粉外含量第二豐富的營(yíng)養(yǎng)成分(20%～33%)[3]，氨基酸組成平衡[4]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。然而，目前食用綠豆蛋白的途徑仍然是將綠豆加工成不同類(lèi)型的食物，如湯和粥等[5]。此外，綠豆蛋白常被作為綠豆淀粉加工的副產(chǎn)品，應(yīng)用于飼料工業(yè)，造成了綠豆蛋白資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

食品乳液通常是以蛋白質(zhì)、多糖、乳化劑、油脂為主體，經(jīng)過(guò)均質(zhì)形成的一類(lèi)分散體系，是食品加工中最復(fù)雜的體系之一[6]，狀態(tài)接近真實(shí)的乳飲料。其在加工過(guò)程和貨架期內(nèi)的穩(wěn)定性容易受環(huán)境因素，如溫度、離子強(qiáng)度及pH等影響[7]，表現(xiàn)為脂肪上浮、蛋白沉淀、質(zhì)感粗糙等，嚴(yán)重影響到食品的外觀和口感，是食品工業(yè)中亟待解決而又難以徹底解決的重要技術(shù)問(wèn)題。目前，關(guān)于綠豆分離蛋白(mung bean protein isolates，MBPI)應(yīng)用于食品乳液的研究和應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道，這與MBPI功能特性較差，尤其是在接近其等電點(diǎn)附近時(shí)(約為pH 4.6)溶解性和乳化性不佳密切相關(guān)[8]。

陰離子多糖常被添加到蛋白穩(wěn)定的酸性乳飲料中，通過(guò)靜電作用和空間位阻效應(yīng)提高乳液的穩(wěn)定性，減緩液滴聚集[9]，改善產(chǎn)品的感官特性[10]。羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)是酸性乳飲料中應(yīng)用廣泛的穩(wěn)定劑，是由D-吡喃葡萄糖通過(guò)β-1,4-糖苷鍵鏈接而成的陰離子型線(xiàn)性多糖[11]。CMC與蛋白在水相體系及乳液體系中的相互作用已有較為深入的研究[9,12]。但CMC與MBPI在乳液體系中的相互作用尚不清楚。基于此，本文擬研究CMC對(duì)MBPI乳液穩(wěn)定性的影響，通過(guò)考察不同pH、CMC濃度和加熱溫度下乳液粒徑、聚集程度、ζ-電位、黏度及分層穩(wěn)定性的變化，揭示CMC引起MBPI乳液穩(wěn)定/失穩(wěn)的內(nèi)在機(jī)制。為綠豆蛋白資源在植物基乳品中的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫皮綠豆，淶水縣金谷糧油食品有限公司；葵花籽油，購(gòu)于北京物美超市；CMC，常熟威怡科技有限公司；HCl、NaOH，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；磷酸鹽緩沖液、尼羅紅、尼羅藍(lán)，北京Solarbio生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)(pH400)，美國(guó)Alalis公司；高速分散器(XHF-DY)，寧波新芝生物科技股份有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)(SCIENTZ-150)，寧波新芝生物科技股份有限公司；激光粒度分析儀(Mastersizer 2000)，英國(guó)Malvern公司；Zeta-電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90)，英國(guó)Malvern公司；流變儀(Physica MCR301)，奧地利Anton Paar有限公司；穩(wěn)定性分析儀(Turbiscan Lab?Expert apparatus)，法國(guó)Formulaction公司；Carl Zeiss蔡司激光共聚焦顯微鏡880(LSM T-PMT)，德國(guó)Carl Zeiss有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MBPI的制備

參考DU等[13]的方法并稍做修改。將脫皮綠豆研磨粉碎至60 目，以質(zhì)量比為1∶15的比例分散于去離子水中，調(diào)節(jié)pH至9.0。在40 ℃，600 r/min下攪拌1 h后4 000 r/min離心20 min。收集上清液調(diào)節(jié)pH至4.5，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀重新分散于去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0。溶液透析24 h除去多余的鹽離子后凍干，凍干物即為MBPI。

1.3.2 乳液的制備

將MBPI和CMC分別分散在去離子水中，室溫下攪拌3 h后置于4 ℃過(guò)夜以確保完全水化，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%MBPI和1%CMC母液。將MBPI、CMC溶液及葵花籽油按照一定比例混合，添加去離子水，配制成MBPI和葵花籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，CMC添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為0%、0.2%、0.4%和0.5%的混合液。將混合液于10 000 r/min下高速剪切1 min后，于常溫、40 MPa下高壓均質(zhì)1次，制備成乳液。用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH，得到pH 7.0 和4.5的乳液，再次在相同條件下均質(zhì)后，置于4 ℃條件下貯藏備用。

1.3.3 粒徑的測(cè)定

采用Mastersizer 2000粒度分布儀測(cè)定乳液液滴粒徑的大小。參數(shù)設(shè)置為：分析模式通用；進(jìn)樣器名Hydro 2 000MU(A)；顆粒折射率1.520；顆粒吸收率0.10；分散劑水；分散劑折射率1.330；泵的轉(zhuǎn)速2 500 r/min；測(cè)定溫度25 ℃。實(shí)驗(yàn)采用體積平均直徑(volume weighted average diameter)d43表征液滴粒度的大小。

1.3.4 ζ-電位的測(cè)定

采用Zetasizer Nano-ZS90電位測(cè)定儀測(cè)定乳液液滴的ζ-電位，參考LIU等[14]的方法并稍作修改。測(cè)定前，樣品采用與其pH相同的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋5倍，測(cè)定溫度25 ℃。

1.3.5 黏度的測(cè)定

根據(jù)WEI等[15]的方法并稍做修改后，采用Physica MCR301流變儀測(cè)定乳液的黏度隨剪切速率的變化。測(cè)定選用不銹鋼平行板轉(zhuǎn)子(pp50Ti)，設(shè)定間距為0.500 mm，測(cè)定溫度25 ℃，平衡時(shí)間3 min，剪切速率從0.1到100 s-1。加樣時(shí)直接把樣品吸取在平板上，使其分布均勻并防止氣泡產(chǎn)生。

1.3.6 放置穩(wěn)定性的測(cè)定

采用Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀測(cè)定，結(jié)果記錄為T(mén)urbiscan穩(wěn)定性指數(shù)(turbiscan stability index，TSI)，其中，TSI越小，乳液越穩(wěn)定。取20 mL新制乳液加入圓柱形玻璃小瓶中，并置于穩(wěn)定性分析儀中，測(cè)定溫度25 ℃，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)24 h，每隔1 h掃描1次，記錄數(shù)值。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

激光共聚焦的測(cè)定參考趙謀明等[16]提到的方法并略微修改，采用萊卡激光共聚焦儀器觀測(cè)乳液的微觀結(jié)構(gòu)。上樣前，在1 mL樣品中加入40 μL混合染料(0.02% 尼羅紅和0.1% 尼羅藍(lán))，充分混合均勻。選用63×油鏡，在顯微鏡下初調(diào)焦，找到乳液液滴分散平面。選擇488 nm的Ar離子和633 nm的He/Ne 離子激光預(yù)掃描，采集熒光圖像。所有液滴熒光圖像按1 024×1 024像素，3×zoom進(jìn)行采集。然后用激光掃描共聚焦顯微鏡LAS AF Lite軟件進(jìn)行圖像分析與數(shù)據(jù)處理。

1.3.8 熱處理對(duì)MBPI乳液穩(wěn)定性的影響

將新鮮制備的乳液分別置于60、80及100 ℃下加熱30 min，冷卻至室溫，放置24 h后，對(duì)其粒徑、ζ-電位、表觀黏度、穩(wěn)定性指數(shù)及乳液微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC和pH對(duì)MBPI乳液ζ-電位的影響

如圖1所示，pH 7.0條件下，添加CMC對(duì)MBPI乳液的ζ-電位未產(chǎn)生顯著影響。這是因?yàn)樵谥行詶l件下，MBPI穩(wěn)定乳液液滴與CMC分子均帶負(fù)電荷，存在較強(qiáng)的靜電斥力，不利于CMC吸附在液滴表面，兩者之間通常很少形成靜電復(fù)合物，所以顆粒的ζ-電位不會(huì)產(chǎn)生明顯變化。在pH 4.5條件下，由于MBPI處于其等電點(diǎn)附近(～pH 4.6)，蛋白發(fā)生較為嚴(yán)重的絮凝，導(dǎo)致乳液失穩(wěn)。隨著CMC添加量的增加，帶有負(fù)電荷的CMC與乳液液滴表面帶有正電荷的MBPI發(fā)生靜電吸附，乳液ζ-電位由正值轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)值，且絕對(duì)值顯著增加，這是由于帶負(fù)電荷的多糖與帶正電荷的綠豆蛋白之間存在靜電絡(luò)合作用，兩者形成了靜電復(fù)合物，所以顆粒ζ-電位絕對(duì)值明顯增加，液滴間的靜電排斥作用得到增強(qiáng)。KOUPANTSIS等[17]報(bào)道了酸性條件下帶負(fù)電荷的CMC吸附到帶正電荷的乳清蛋白表面和酪蛋白酸鈉表面，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。

圖1 CMC添加量和pH對(duì)MBPI乳液ζ-電位的影響Fig.1 Effects of CMC concentration and pH on the ζ-potential of MBPI-stabilized emulsions

2.2 CMC和pH對(duì)MBPI乳液聚集行為的影響

如圖2所示，在pH 7.0條件下，隨著CMC添加量由0提高到0.5%，MBPI乳液液滴粒徑由2.35 μm增加至4.16 μm。圖3-a激光共聚焦顯微觀測(cè)結(jié)果也證實(shí)添加CMC引起液滴發(fā)生了不同程度的絮凝，并產(chǎn)生微觀相分離。這是由分散相中未吸附多糖分子誘發(fā)的液滴排斥絮凝所造成[16]，這種狀態(tài)的絮凝液滴間相互作用力較弱，容易被稀釋、振蕩、攪拌等物理作用破壞，一般是可逆的[18]。

在pH 4.5條件下，未添加CMC的乳液發(fā)生了嚴(yán)重的絮凝(圖3-b)，液滴的粒徑達(dá)到33.5 μm(圖2)。這主要是因?yàn)镸BPI在等電點(diǎn)附近電荷量接近0，液滴之間的靜電斥力不足以克服范德華力和疏水相互作用等吸引力，從而發(fā)生聚集。CMC的添加可顯著降低乳液液滴粒徑，且當(dāng)CMC添加量增加到0.4%時(shí)，液滴分散均勻，粒徑減小到1.08 μm，蛋白在酸性條件下的聚集得到抑制(圖3-b)。這與CMC在液滴表面的吸附，提高了液滴間的靜電排斥和空間位阻效應(yīng)密切相關(guān)。LIU等[19]也證實(shí)了添加0.2%的高甲氧基果膠或SSPS都可以抑制酪蛋白酸鈉乳液液滴的聚集，這與本實(shí)驗(yàn)報(bào)道現(xiàn)象相一致。

圖2 CMC添加量和pH對(duì)MBPI乳液粒徑的影響Fig.2 Effects of CMC concentration and pH on the mean droplet diameter (d43) of MBPI-stabilized emulsions

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖3 CMC添加量和pH對(duì)MBPI乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of CMC concentration and pH on the microstructure of MBPI-stabilized emulsions注：圖中紅色為油脂；綠色為蛋白

2.3 CMC和pH對(duì)MBPI乳液黏度的影響

根據(jù)斯托克斯定律，較高的黏度有助于阻止或延遲蛋白包裹液滴之間的相互聚集[20]。由圖4可知，pH 7.0條件下，未添加CMC的乳液黏度很低，隨著CMC添加量增加，乳液的黏度逐漸增加。而在pH 4.5條件下，未添加CMC的乳液具有較高的黏度，這可能與體系發(fā)生嚴(yán)重的絮凝有關(guān)。隨著CMC濃度的增加，體系黏度顯著降低。推測(cè)這可能與CMC吸附于MBPI穩(wěn)定的液滴表面，造成連續(xù)相中多糖濃度的降低有關(guān)。而當(dāng)CMC添加量達(dá)到0.5%時(shí)，體系的黏度顯著升高。圖1的結(jié)果也表明，當(dāng)CMC添加量超過(guò)0.4%時(shí)，液滴的ζ-電位不再增加。表明此時(shí)，CMC在MBPI穩(wěn)定的液滴表面發(fā)生了飽和吸附。因此，添加0.5%CMC時(shí)，過(guò)量的CMC將分散于分散相中，引起黏度升高[20]。

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖4 CMC添加量和pH對(duì)MBPI乳液黏度的影響Fig.4 Effects of CMC concentration and pH on the viscosity of MBPI-stabilized emulsions

2.4 CMC和pH對(duì)MBPI乳液穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，在pH 7.0條件下，未添加CMC的乳液具有較好的穩(wěn)定性，在25 ℃放置24 h，未產(chǎn)生明顯的分層現(xiàn)象(圖6)。添加0.2%CMC引起乳液的分層，樣品底部出現(xiàn)水析層。隨著CMC添加量的增加，穩(wěn)定性得到了增強(qiáng)，水析現(xiàn)象得到抑制。在pH 4.5條件下，MBPI乳液發(fā)生嚴(yán)重的失穩(wěn)，分層現(xiàn)象嚴(yán)重。與中性條件下的變化趨勢(shì)相一致，當(dāng)添加少量CMC(0.2%)時(shí)，TSI增加，穩(wěn)定性顯著降低。而當(dāng)CMC添加量提高到0.4%以上時(shí)，TSI明顯減小，乳液具有很好的穩(wěn)定性，未出現(xiàn)分層。ZHAO等[21]研究顯示當(dāng)乳鐵蛋白乳液中添加0.05%～0.15%大豆多糖或甜菜果膠時(shí)，乳液發(fā)生橋連絮凝，而添加量超過(guò)0.35%時(shí)，乳液具有較好的穩(wěn)定性。

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖5 CMC添加量和pH對(duì)MBPI乳液TSI的影響Fig.5 Effects of CMC concentration and pH on the TSI of MBPI-stabilized emulsions

a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液圖6 CMC添加量和pH對(duì)MBPI乳液分層情況的影響Fig.6 Effects of CMC concentration and pH on the stratification of MBPI-stabilized emulsions

2.5 熱處理對(duì)MBPI-CMC乳液穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，在pH 7.0和pH 4.5條件下，添加0.4%CMC的MBPI乳液在本研究所考察的熱處理溫度下，均未出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象。如圖8所示， TSI測(cè)定的結(jié)果表明，當(dāng)加熱溫度由60 ℃增加到80 ℃時(shí)，不同pH體系的穩(wěn)定性未發(fā)生明顯變化；隨著加熱溫度繼續(xù)提高到100 ℃，體系的穩(wěn)定性顯著降低。如圖9所示，粒徑測(cè)定的結(jié)果表明，對(duì)于中性乳液，加熱對(duì)液滴粒徑的影響較小，但加熱至100 ℃，體系發(fā)生明顯的微觀相分離(圖10)。同時(shí)，pH 7.0條件下加熱，未對(duì)樣品的黏度產(chǎn)生顯著影響(圖11)。對(duì)于pH 4.5的乳液體系，當(dāng)溫度增加至80 ℃和100 ℃，液滴粒徑顯著增加(圖9)。圖11黏度結(jié)果也顯示加熱引起了液滴粒徑的增加和絮凝，導(dǎo)致樣品表觀黏度有一定程度的增加。

圖7 熱處理溫度對(duì)MBPI-CMC乳液分層情況的影響Fig.7 Effect of temperature on the stratification of MBPI-CMC-stabilized emulsions

3 結(jié)論

(1) 在pH 7.0條件下，CMC與吸附于乳液液滴表面的MBPI未發(fā)生明顯吸附。CMC主要存在于分散相中，誘導(dǎo)液滴發(fā)生排斥絮凝。當(dāng)CMC添加量較低(≤0.2%)，其對(duì)體系黏度的貢獻(xiàn)不足以抵抗液滴間的排斥作用時(shí)，體系產(chǎn)生失穩(wěn)現(xiàn)象，樣品底部出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的水析層。隨著CMC添加量增加，體系黏度增加，宏觀的相分離被抑制。

a-pH 7.0 MBPI-CMC乳液;b-pH 4.5 MBPI-CMC乳液圖8 熱處理溫度對(duì)MBPI-CMC乳液TSI的影響Fig.8 Effect of temperature on the TSI of MBPI-CMC-stabilized emulsions

圖9 熱處理溫度對(duì)MBPI-CMC乳液粒徑的影響Fig.9 Effect of temperature on the mean droplet diameter (d43) of MBPI-CMC-stabilized emulsions

a-pH 7.0 MBPI-CMC乳液;b-pH 4.5 MBPI-CMC乳液圖10 熱處理溫度對(duì)MBPI-CMC乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.10 Effect of temperature on the microstructure of MBPI-CMC-stabilized emulsions注：圖中紅色為油脂；綠色為蛋白

圖11 熱處理溫度對(duì)MBPI-CMC乳液黏度的影響Fig.11 Effect of temperature on the viscosity of MBPI-CMC-stabilized emulsions

(2) 在pH 4.5條件下，CMC與液滴表面帶有相反電荷的MBPI發(fā)生靜電吸附作用，當(dāng)多糖濃度≥0.4% 時(shí)，多糖通過(guò)靜電作用和空間位阻效應(yīng)穩(wěn)定液滴，獲得分散均勻的乳液體系。此時(shí)CMC對(duì)體系的黏度貢獻(xiàn)較小，不是酸性乳液穩(wěn)定性提高的關(guān)鍵因素。

(3) 在熱處理?xiàng)l件下(60～100 ℃，30 min)，添加0.4%CMC的中性和酸性MBPI乳液均發(fā)生了絮凝，并且酸性條件下，液滴粒徑增加較為顯著。但不同溫度下處理的樣品，均未發(fā)生宏觀的失穩(wěn)現(xiàn)象,表明CMC穩(wěn)定的MBPI乳液具有一定的熱穩(wěn)定性。