四株益生菌對發酵酸奶保質期理化特性和益生菌數的影響

任然，唐善虎,李思寧，馬國麗，劉慧倫

(西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都， 610041)

Effectoffourprobioticsonthephysicochemicalpropertiesandprobioticsviabilityoffermentedyogurt

REN Ran,TANG Shanhu*,LI Sining,MA Guoli,LIU Huilun

(College of Life Science and Technology, Southwest Min Zu University, Chengdu 610041, China)

ABSTRACTFresh milk was used as raw material, and the yogurt cultures was co-fermented withBifidobacteriumanimalis(A-Ba),Lactobacillusplantarum(A-Lp),Lactobacilluscasei(A-Lc) andLactobacillusacidophilus(A-La) to prepare solidified yogurt, respectively. Viability of lactic acid bacteria, acidity, diacetyl contents, acetaldehyde contents and water holding capacity (WHC) were measured and the changes of physicochemical properties and probiotics were evaluated for the yogurt stored at 4 ℃ for 28 days, and the correlation between the measurements was analyzed. The results showed that the viability ofL.caseiwas the highest, followed byB.animalis,L.plantarum, andL.acidophilus(P<0.05) in the storage period. The survival rates ofS.thermophilusin the treated group and the control group elevated first and then decreased (P<0.05). Moreover, A-Lc had relatively higher diacetyl content and better butter flavor during storage period. After 7 days of storage, the content of acetaldehyde of A-Lc was better, which was better than that of other treatment groups. During the storage period, the WHC of yogurt showed an increasing trend. A-La was only lower than A-Lp on day 1～21, and the WHC on day 28 was the lowest in each group (P<0.05). There was no significant difference between A-Ba and group A in WHC during storage (P>0.05). The WHC of A-Lc was the lowest in each group (P<0.05). When yogurt was stored for 28 days,L.acidophilushad the largest capacity for acid production, followed byL.plantarumandL.casei, and the weakest wasB.animalis. According to the correlation analysis, after stored at 4 ℃ for 28 days, the acidity was negatively correlated with the viability and diacetyl content, while positively correlated with acetaldehyde and WHC.

Keywordsco-fermentation;physicochemical properties; viability of lactic acid bacteria

益生菌是通過改善腸道微生物平衡對宿主產生有益影響的一類微生物[1]。作為益生菌，應具備對宿主無致病性和毒性、含有大量活細胞、能夠在腸道內存活和代謝等特性，而益生菌產品需含有足夠量的活細菌才能在腸道中發揮作用[2]。除了改善腸道健康外，益生菌對其他疾病也具有有益作用，比如乳糖不耐癥、癌癥、過敏、肝病、幽門螺桿菌感染、尿路感染和高脂血癥等[3]。

酸奶是人體攝入食物時益生菌的最好載體之一，同時添加益生菌有利于酸奶的發酵。過去酸奶的制作多用單株菌種發酵，導致酸奶發酵時間長，凝固性差，而采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為基礎發酵劑，與益生菌共發酵可解決這個問題。關于酸奶制作過程添加益生菌進行共發酵的研究已有部分報道。KORBEKANDI等將基礎發酵劑與干酪乳桿菌共發酵，在5 ℃貯藏21 d，對其pH值、活菌數、感官進行了分析，發現酸奶在貯藏期感官特性均無顯著變化，pH值、活菌數持續降低，但仍高于益生菌產品的標準[4]；MANI-LPEZ利用基礎發酵劑分別與嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌共發酵，研究其滴定酸度、持水力、活菌數、感官在5 ℃貯藏35 d的變化，未發現明顯的感官變化，但是乳酸從0.09%增加到0.29%，活菌數保持在糧農組織建議水平[5]；尚楠等將雙歧桿菌與基礎發酵劑共發酵，在4 ℃下貯藏20 d，發現酸奶酸度為100～110 °T，活菌數≥106CFU/mL，酸奶持水力呈下降趨勢，最高可達90%[6]；LI等研究了部分益生菌與嗜熱鏈球菌發酵對貯藏期理化特性變化[7]。

目前，同時將基礎發酵劑與雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌復合發酵制作酸奶，比較各酸奶在貯藏期理化特性和益生菌數的研究尚未見報道，本試驗旨在研究4株益生菌酸奶在4 ℃貯藏28 d理化特性和益生菌數變化，系統比較分析添加不同益生菌復合發酵對酸奶貯藏期品質的影響規律，為益生菌酸奶的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株和處理組：本試驗共分成5組，每組按照試驗設計添加對應的發酵劑進行酸奶的制備。對照組，添加嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)混合菌種，丹麥Danisco公司，記為A；處理組，分別在混合菌株基礎上添加雙歧桿菌CICC-21717(Bifidobacteriumanimalis)，記為A-Ba，添加植物乳桿菌CICC-20263(Lactobacillusplantarum)，記為A-Lp，添加干酪乳桿菌CICC-20280(Lactobacilluscasei)，記為A-Lc，添加嗜酸乳桿菌CICC-20248(Lactobacillusacidophilus)，記為A-La，益生菌菌株，中國工業微生物菌種保藏管理中心；鮮牛奶，新希望乳業；蔗糖，太古糖業；NaCl、NaOH、酚酞、雙乙酰、三氯乙酸、鄰苯二胺、HCl、NaHSO3、NaHCO3、淀粉、碘、KI均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

DHP-9052型電熱恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；NS1001L型高壓均質機，意大利NiroSoavi公司；PL303分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；UV-2102 PCS型紫外分光光度計，龍尼克儀器有限公司；GL-21M離心機，上海市離心機械研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸奶制作工藝流程

所有酸奶制作按照以下流程進行：

主要操作過程為將鮮牛乳置于大燒杯中進行水浴加熱至70 ℃，加入質量濃度為60 g/L蔗糖，混合均勻后將牛奶冷卻至45 ℃再進行均質；隨后進行巴氏殺菌處理，將牛奶加熱至90 ℃保持10 min；殺菌結束后冷卻至40～45 ℃接種菌株，先將混合菌粉按照計算量加入一定量的牛奶中溶解再分裝至已消毒的酸奶杯中，然后將4株益生菌母發酵劑以2×107CFU/mL的計算量分別接種于酸奶杯中，加入殺菌冷卻后的牛奶，混合均勻后分裝[8]，放入37 ℃培養箱中發酵；酸奶發酵結束后迅速冷卻，放入4 ℃進行貯藏；分別于1、7、14、21、28 d對酸奶樣品進行檢測。

1.3.2 活菌數的檢測

稱取25 g酸奶樣品，與225 mL 9 g/L生理鹽水混合于無菌均質袋中，用無菌均質機進行拍打至混合均勻，吸取1 mL混合樣品進行梯度稀釋，每一梯度稀釋倍數均為10倍；選取適宜的2～3梯度進行平板計數，吸取1 mL至培養皿中，再倒入15～20 mL的選擇培養基；培養基凝固后倒置在37 ℃培養箱中培養。其中嗜酸乳桿菌選擇培養基為克林霉素-乳酸細菌(Man Rogosa Sharpe Medoum，MRS)培養基[9]，雙歧桿菌選擇培養基為BL培養基[10]，植物乳桿菌為植物乳桿菌選擇培養基[11]，干酪乳桿菌選擇培養基為萬古霉素-MRS培養基[12]，嗜熱鏈球菌為M17培養基[13]。培養結束后，對平板進行計數，選擇30～300的菌落數，計算后結果為每毫升菌落形成數量，單位為CFU/mL[4]。

1.3.3 酸奶酸度的測定

采用滴定法測定發酵乳的酸度[14]，取發酵乳樣品5.0 g，加入5 mL蒸餾水，混合均勻，加入2滴5 g/L的酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定至淡粉色，1 min內不褪色，同時做空白試驗，根據所消耗NaOH標準溶液的量計算出滴定酸度(°T)。

1.3.4 雙乙酰的測定

參考邵亞東報道的雙乙酰的測定方法進行[15]。按照參考的測定方法繪制雙乙酰標準曲線。得到標準曲線后，取待測酸奶樣品30 g，加入30 mL質量分數為16%的三氯乙酸溶液混勻，4 ℃，4 500 r/min離心10 min，將上清液再用濾紙過濾一遍，以保證澄清，同時做空白試驗。每個樣品取10 mL裝入離心管中，分2組，一組為空白試驗。再按照制作標準曲線的操作測定樣品在335 nm下的吸光度。

1.3.5 乙醛的測定

參考劉寧寧測乙醛含量的方法[16]。取上清液備用(同測定雙乙酰處理方法)。再精確量取2.0 mL 10 g/L的NaHSO3溶液于三角瓶中，加入處理后的酸奶上清液10 mL，搖勻，在室溫下放置1 h后，加入1 mL 10 g/L淀粉溶液(現配現用)，用0.01 mol/L I2標準溶液滴定至終點(淡藍紫色，30 s內不褪色)，不計數。再加20 mL 1 mol/L的NaHCO3，振蕩混勻至溶液藍色消失，用0.01 mol/L I2標準溶液滴定至終點，記錄消耗的標準碘液的體積，同時做空白試驗,乙醛含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中:V1，樣品滴定消耗I2標準溶液的體積,mL；V2，空白滴定消耗I2標準溶液的體積,mL；C，1/2 I2標準溶液的濃度,mol/L；0.022，乙醛化學反應基本單位,g；10，乙醛樣品稱樣量,mL。

1.3.6 持水力的測定

根據RIENER等報道的方法稍作修改進行[17]。離心管稱重，質量為m1；取酸奶10 g左右，記m2；室溫下5 000 r/min離心30 min，棄上清液，離心管倒置10 min后立即稱重，質量為m3，酸奶持水力為酸奶離心后的沉淀物與樣品的百分比，計算持水力(water holding capacity，WHC)，如公式(2)所示：

(2)

1.3.7 數據處理

益生菌酸奶滴定酸度、活菌數、雙乙酰含量、乙醛含量和相關性分析均通過SPSS進行ANOVA分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 貯藏期酸奶酸度的變化

圖1為益生菌酸奶貯藏28 d各個時間點的滴定酸度變化，各組的滴定酸度均達到國家標準(°T>70)，在貯藏期均為上升趨勢。在貯藏過程中，對照組的酸度均低于處理組的酸度。在試驗組之間，A-La組酸度在1～21 d始終為最高，范圍在88～104 °T，但在28 d時，A-Lc組酸度高于A-La組，且在試驗組之間酸度最高，A-Lc組酸度為82～108 °T，說明嗜酸乳桿菌與干酪乳桿菌發酵酸奶在發酵過程中所產的乳酸與后酸化的疊加效果更大，貯藏28 d后酸度均達到100 °T以上。A-Lp組在1～14 d酸度快速上升，在21與28 d酸度上升緩慢，為75～96 °T；A-Ba組的酸度最低，為75～88 °T。處理組之間酸度變化不同，推測其原因為不同益生菌發酵乳中保加利亞乳桿菌的過度酸化程度不同[18]。綜上所述，4株益生菌中產酸能力最強為嗜酸乳桿菌，其次為干酪乳桿菌，再者為植物乳桿菌，最后為雙歧桿菌。

圖1 四株益生菌發酵酸奶在貯藏期滴定酸度變化Fig.1 Changes in titratable acidity of four probiotic yoghurt during storage

2.2 貯藏期活菌數的變化

酸奶制作過程中各類益生菌經過發酵后活菌數存在明顯差異(表1)。在貯藏過程中，Lc的活菌數顯著高于其余益生菌(P<0.05)，說明Lc更加適應酸奶的酸環境。當貯藏1～14 d時，4組試驗組的活菌數也存在顯著差異(P<0.05)；而貯藏至21 d時，La和Lp活菌數顯著低于Lc和Ba，且La和Lp之間尚未存在顯著性差異(P>0.05)。隨著貯藏時間的延長，Lc和Lp的活菌數均呈顯著下降趨勢(P<0.05)，但在28 d時，Lc的活菌數較21 d有顯著增加(P<0.05)，其原因可能為試驗誤差所致；而La和Ba均呈先上升后下降趨勢，La在貯藏第14天達到峰值，Ba在第7天達到峰值。同時，這4株益生菌中，Ba的下降速率快，保加利亞乳桿菌形成H2O2是混合培養中失去Ba的主要因素[19]。益生菌的存活率受貯藏期酸奶酸度變化的影響，隨著酸奶酸度的增加，益生菌的存活率下降，并且保加利亞乳桿菌在貯藏期產生的H2O2，不僅會導致保加利亞乳桿菌對酸乳桿菌產生拮抗作用[19]，而且還會損害酸奶中部分益生菌[20]，進而使益生菌活菌數下降。本研究中發現4株益生菌在酸奶貯藏28 d后活菌數均在1×107CFU/mL以上，保持在聯合國糧食及農業組織建議水平(>1×107cfu/mL)之上。

表1 四株益生菌發酵酸奶在貯藏期益生菌的存活率Table 1 Viability of four strains of probiotic fermented yogurt during storage period

在4 ℃貯藏過程中，A-Ba組的嗜熱鏈球菌活菌數在1～21 d時顯著高于其余組(P<0.05)，且在貯藏28 d內活菌數減少速率較其余組快，可能是保加利亞乳桿菌產生的H2O2影響嗜熱鏈球菌的生長；在21 d時，A-Lc組顯著低于其余組(P<0.05)，可能是由于A-Lc組經過貯藏后，酸度較高，導致活菌數降低；而A-La、A-Ba和A-Lp組均高于A組且無顯著差異(P>0.05)。28 d時，A-Lp與A組顯著低于A-La、A-Ba組(P<0.05)。隨著貯藏時間的延長，A組嗜熱鏈球菌活菌數呈下降趨勢；而A-Lc、A-La、A-Ba和A-Lp組均呈先上升后下降的趨勢，A-Lc組在28 d時呈上升趨勢，可能是由于試驗誤差所致。此外，4組處理組均在貯藏第7天達到峰值。這一結果與DAVE等的研究報道結果一致[20]。DAVE等研究發現，嗜熱鏈球菌在貯藏14 d內呈上升趨勢，隨后下降，貯藏期內的計數仍在107CFU/mL以上[20]。嗜熱鏈球菌活菌數的下降與酸奶滴定酸度的升高有關，隨著乳酸菌分解乳糖產酸，體系酸度增加，乳酸菌的生長也受到抑制，同時，隨著貯藏時間的延長，體系中乳酸菌能利用的營養成分也逐漸減少，導致酸奶中活菌數減少(表2)。

表2 對照組與處理組中嗜熱鏈球菌在貯藏期的存活率Table 2 Viability of S.thermophilus during storage in control and treatment groups

2.3 雙乙酰含量變化

雙乙酰被認為是主要的芳香化合物之一，其帶有奶油香味[21]。A-La組在貯藏過程中呈下降趨勢，1 d時雙乙酰含量為各組中最高(P<0.05)，7～21 d雙乙酰含量差異不顯著(P>0.05)，28 d雙乙酰含量顯著低于前21 d，但顯著高于其余組(P<0.05)；A-Ba組雙乙酰含量在14 d達到最大值，隨后下降；A、A-Lc、A-Ba組均呈先上升再下降的趨勢。A-Lp組雙乙酰含量從7 d開始下降，7～21 d均為各組中最低；A-Lc組在7～21 d雙乙酰含量明顯高于其余處理組，14 d時達到最大值，在28 d時迅速下降至各組中最低(P<0.05)，可能是28 d A-Lc組pH值上升，使得酸奶的雙乙酰含量下降(圖2)。雙乙酰是酸奶后發酵過程中一些香味細菌產生的，所以A-Lc組的后發酵過程更利于雙乙酰的生成，A-Lc組在貯藏期奶油香味更佳[22]。各組雙乙酰含量在28 d時下降，隨著酸奶酸度的增加，乳酸菌與某些香味細菌存活率降低且伴隨著乳糖利用率降低，這有可能是導致雙乙酰含量下降的原因。

圖2 對照組與處理組在貯藏期雙乙酰質量濃度的變化Fig.2 Changes in diacetyl content of four probiotic yoghurt during storage注：小寫字母表示益生菌貯藏28 d各時間點之間的差異，大寫字母表示同一時間點不同益生菌之間的差異(P<0.05)(下同)

2.4 酸奶在貯藏期乙醛含量的變化

乙醛也是酸奶滋味的主要風味物質之一，乳酸菌通過糖酵解(glycolytic pathway，EMP)途徑產生丙酮酸，丙酮酸有限轉化為乳酸，殘留的丙酮酸轉化為乙醛，在酸奶發酵過程中主要通過脫氧核糖5-磷酸在脫氧核糖醛縮酶催化作用下生成以及蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶催化作用下降解生成[21, 23]。由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，A-La和A-Ba組乙醛含量均呈先上升后下降的趨勢，且21 d時乙醛含量達到最大。同時，在21與28 d時，A-La組的乙醛含量均顯著高于其余處理組(P<0.05)。此外，在貯藏期A組乙醛含量呈逐漸上升趨勢；A-Lp組呈先下降后上升再下降趨勢，在21 d達到峰值；A-Lc組呈先上升后下降再上升趨勢，在14 d達到峰值，且顯著高于其余組(P<0.05)。乙醛呈清爽的芳香味，但若含量過高，也會產生不愉悅的味道，一般認為乙醛最佳風味值為20～40 mg/L[24]，A組在貯藏期均達到最佳風味值，A-Lc組貯藏7 d之后均達到最佳風味值，優于其余處理組。乙醛是由酸奶中保加利亞乳桿菌所產生，因此酸奶在貯藏期的后酸化對乙醛也會產生影響，且乙醛含量隨酸奶酸度的增加而增加[25]，其可能是A-Lc乙醛含量優于其余組所致。

圖3 對照組與處理組在貯藏期乙醛含量的變化Fig.3 Changes in Acetaldehyde content of four probiotic yoghurt during storage

2.5 酸奶的持水力在貯藏期的變化

酸奶持有全部或部分自身水的能力被定義為酸奶的持水力[26]。持水力變化如圖4所示，在酸奶貯藏過程中，1、21和28 d時，各組之間均無顯著差異性(P>0.05)；第7天時，A-Lp組持水力顯著高于其余4組(P<0.05)；第14天時，A-La、A-Lp組持水力顯著高于A-Lc組(P<0.05)。此外，在貯藏期間A-Ba與A組的持水力差異不顯著(P>0.05)。隨著貯藏時間的延長，處理組與對照組持水力均呈上升趨勢，這與DAN等的研究結果一致[27]。A-La組在1～21 d僅低于A-Lp組，28 d持水力下降為各組中最低(P<0.05)；A-Ba與A組在貯藏過程中持水力相差不大(P>0.05)；A-Lc組持水力為各組中最低(P<0.05)。不同益生菌酸奶持水力不同可能與益生菌分泌的胞外多糖有關[28]，胞外多糖能增強酸奶的持水能力，有利于防止乳清的析出[29]。

圖4 對照組與處理組在貯藏期持水力的變化Fig.4 Changes in water holding capacity of four probiotic yoghurt during storage

2.6 相關性分析

表3為4組處理組指標間的相關性分析。由表3可知，A-La、A-Ba、A-Lp、A-L組的益生菌數與嗜熱鏈球菌數均呈較強的正相關。A-Lac組滴定酸度與乙醛含量、持水力呈正相關，與益生菌數、嗜熱鏈球菌數、雙乙酰含量呈負相關；A-Lc組滴定酸度與乙醛含量、持水力呈正相關，與益生菌數、嗜熱鏈球菌數、雙乙酰含量呈負相關。A-Ba、A-Lp組的滴定酸度與益生菌數、嗜熱鏈球菌數、雙乙酰含量呈負相關，與乙醛含量、持水力呈正相關。4組處理組的滴定酸度與活菌數，雙乙酰含量均呈負相關，與乙醛含量、持水力呈正相關。上述試驗結果表明酸奶酸度是導致活菌數降低的主要因素。此外，酸度較高的環境導致部分產香的菌種無法生存，進而導致雙乙酰含量下降。然而貯藏期滴定酸度的上升，使得乙醛含量隨之上升，較強的后酸化會使酸奶風味降低。同時，持水力的增加不僅與滴定酸度有關，還與菌種本身分泌的胞外多糖密切相關。

表3 各指標間的相關性分析Table 3 Correlation analysis between indicators

3 結論

本研究發現，酸奶在28 d貯藏過程中4株益生菌存活率均下降；但是，Lc含量明顯高于其余3株益生菌，其次為Ba活菌數，La與Lp較低。各組滴定酸度在貯藏期均呈上升趨勢，4株益生菌的產酸能力強弱順序依次為嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌。A-Lc組的雙乙酰含量在1～21 d明顯高于其余組；A-Lc組貯藏7 的d之后均達到最佳風味值，優于其余處理組。A-La與A-Lp組在1～21 d持水力最高，28 d時A-Lc組持水力最高，各處理組持水力的差異可能是由于不同益生菌分泌胞外多糖的能力不同。由相關性分析可知，4組處理組的滴定酸度與益生菌數、嗜熱鏈球菌數、雙乙酰含量均呈負相關，與乙醛、持水力呈正相關。綜上所述，酸奶的活菌數、雙乙酰含量、乙醛含量、持水力均與酸奶發酵過程菌種排酸及后酸化有關，4株益生菌酸奶產酸能力最強的為A-La組，其次為是A-Lc組，再者為A-Lp組，最后為A-Ba組。