御唐丸對糖尿病胰島素抵抗大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路的影響

張良，何秀麗，鄭南，井宏穎，韓玉生*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008)

2型糖尿病所引起的胰導素抵抗(IR)使機體對胰島素的敏感性降低，臨床上改善胰島素抵抗的口服藥如二甲雙胍、羅格列酮和吡格列酮等存在各種副作用，不利于病人長期服[1-2]。臨床與實驗研究表明中藥御唐丸可有效降糖、降脂，改善 2 型糖尿病患者的胰島素抵抗，對糖尿病模型大鼠糖脂代謝具有明顯的改善作用[3-6]。本文研究御唐丸對糖尿病大鼠肝臟組織中 PI3Kp85和AKT2 蛋白和基因表達的影響，進一步探討其降糖的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠80只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(黑)2013-0004。自由飲食，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥物及試劑

御唐丸由西洋參、山藥、龜板、鹿茸、玉竹、葛根、烏梅、黃芪、麥冬、山萸肉、女貞子、白芍等組成，由黑龍江省中西醫(yī)結合研究所制劑室生產(chǎn)；二甲雙胍(北京京豐制藥，批號：H11021518)；高糖高脂飼料由25%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、20%蔗糖、62.5%基礎飼料等組成；鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigma；胰島素ELISA檢測試劑盒、兔抗PI3Kp85和AKT2多克隆抗體，武漢博士德;PCR引物及抽提試劑等均由大連寶生物提供。

1.3 儀器

2135型組織切片機，德國菜卡；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)，美國Motic； DNM-9602型酶標儀，北京普朗新技術有限公司；熒光定量PCR，美國ABI。

2 方法

2.1 模型制備及分組給藥

實驗前檢測大鼠全血血糖，剔除血糖異常者，再隨機分為正常組(10只)和高糖高脂喂養(yǎng)組(60只)，分別予以普通飼料和高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周。高糖高脂組大鼠禁食禁水12 h后，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液，連續(xù)觀察3 d。篩選空腹血糖≥16.7 mmol/L者為模型制備成功。將造模成功大鼠再隨機分為模型組、二甲雙胍組，御唐丸低、中、高劑量組，繼續(xù)喂以高脂飼料。二甲雙胍組灌胃給予濃度為0.2 g/kg的二甲雙胍混懸液；御唐丸低、中、高劑量組分別灌胃給予濃度為 0.675、1.35、2.70 g/kg的御唐丸混懸液；正常組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。干預4周后處死大鼠，留取血清及肝臟組織。

2.2 指標檢測

2.2.1 大鼠空腹血糖(FBG)測定

大鼠尾尖取血，采用微量血糖測定儀進行檢測，分別于造模前、造模后和治療后進行監(jiān)測大鼠FBG變化。

2.2.2 大鼠空腹血清胰島素(FINS)測定

各組大鼠在末次給藥后禁食禁水12 h，取血分離血清，嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。

2.2.3 胰島素敏感系數(shù)(ISI)的測定

根據(jù)公式對各組大鼠ISI進行分析[7]，ISI=Ln[1/(FINS×FBG)]，即FBG與FINS乘積倒數(shù)的自然對數(shù)。

2.2.4 免疫組化法檢測肝臟PI3Kp85a、AKT2蛋白表達

肝臟組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后切片，PV二步法檢測PI3Kp85a、AKT2蛋白表達。Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)在400倍視野下攝影，每組每例隨機選取3不同視野，采用Motic image 3.2圖像分析軟件進行分析，以平均灰度值代表蛋白含量的多少。

2.2.5 RT-PCR法檢測PI3Kp85a、AKT2mRNA表達

液氮凍存的肝組織經(jīng)研磨后，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測PI3Kp85a、AKT2mRNA表達。見表1。

表1 引物序列表

2.3 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 對大鼠空腹血糖(FBG)的影響

造模后各大鼠FBG顯著升高，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；治療后各治療組FBG均有不同程度的降低，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)，其中以御唐丸高劑量組降低最為明顯。見表2。

表2 各組大鼠FBG比較

3.2 對大鼠空腹血清胰島素(FINS)的影

與空白組相比較，模型組FINS水平明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠FINS均有不同程度的升高，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表3。

表3 各組大鼠FINS比較

3.3 對大鼠胰島素敏感系數(shù)(ISI)的影響

模型組大鼠胰島素敏感系數(shù)明顯降低，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠胰島素敏感系數(shù)均有不同程度的升高，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表4。

表4 各組大鼠ISI比較

3.4 對大鼠肝臟PI3Kp85a、AKT2蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，PI3Kp85a、AKT2蛋白主要表達在肝細胞胞質(zhì)中，陽性表達呈黃色或棕黃色顆粒狀。模型組大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2蛋白相對含量明顯減少，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2蛋白相對含量均有不同程度的增加，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.05或0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表5。

表5 PI3Kp85a、AKT2免疫組織化學染色平均灰度值比較

3.5 對大鼠PI3Kp85a、AKT2mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，模型組大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2mRNA表達明顯減少，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2mRNA表達量均有不同程度的增加，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表5。

表5 治療后各組大鼠PI3Kp85amRNA、AKT2mRNA表達

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的病理基礎是機體內(nèi)糖脂代謝障礙[8-9]，不良的飲食習慣和生活方式是誘發(fā)糖尿病發(fā)病率逐年上升的重要原因，由于過量攝入高糖高脂食物，使機體脂質(zhì)代謝紊亂，導致胰島抵抗(IR)的發(fā)生[10]。IR是指機體中胰島素的生理效應降低，或各種原因引起的組織對胰島素反應能力下降。本實驗采用高糖高脂飼料結合STZ誘導大鼠糖尿病模型，模擬人類2型糖尿病IR的病理過程，結果顯示FBG水平明顯升高，F(xiàn)INS水平明顯降低，胰島素敏感系數(shù)明顯降低，表明此方法制備的大鼠2型糖尿病模型產(chǎn)生了明顯的胰島素抵抗。經(jīng)御唐丸治療后，F(xiàn)BG水平有不同程度的降低，F(xiàn)INS水平也有不同程度的升高，胰島素敏感系數(shù)明為增強，表明御唐丸對胰島素抵抗具有顯著的改善作用。

胰島素必須與相應的受體結合后，激活相關的級聯(lián)酶促反應，產(chǎn)生一系列的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，才能最終發(fā)揮其生理效應[11]，其中PI3K/AKT信號途徑是調(diào)控胰島素水平的主要信號通路之一。正常情況下，胰島素與其受體結合后，活化酪氨酸激酶產(chǎn)生自磷酸化，進而促進SH2與PI3Kp85結合并活化PI3K ，經(jīng)過一系列催化過程激活AKT，激活的 AKT使下游的GSK-3β磷酸化，肝臟中肝糖原的合成增加，維持機體血糖的正常水平[12-13]。糖尿病時胰島素抵抗狀態(tài)下，胰島素水平或者效能不足，GSK -3β磷酸化減少，使肝糖原含量下降，導致體內(nèi)血糖水平升高[14]。本實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表達量均顯著下調(diào)，御唐丸低、中、高劑量組大鼠肝組織中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表達量均有不同程度的上調(diào)。提示御唐丸可以通過激活 PI3K/Akt 信號通路，改善糖尿病大鼠胰島素抵抗狀態(tài)，進而發(fā)揮治療糖尿病的作用。