御唐丸對糖尿病胰島素抵抗大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路的影響

張良，何秀麗，鄭南，井宏穎，韓玉生*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008)

2型糖尿病所引起的胰導素抵抗(IR)使機體對胰島素的敏感性降低，臨床上改善胰島素抵抗的口服藥如二甲雙胍、羅格列酮和吡格列酮等存在各種副作用，不利于病人長期服[1-2]。臨床與實驗研究表明中藥御唐丸可有效降糖、降脂，改善 2 型糖尿病患者的胰島素抵抗，對糖尿病模型大鼠糖脂代謝具有明顯的改善作用[3-6]。本文研究御唐丸對糖尿病大鼠肝臟組織中 PI3Kp85和AKT2 蛋白和基因表達的影響，進一步探討其降糖的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠80只，雄性，體質量(200±20)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(黑)2013-0004。自由飲食，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 藥物及試劑

御唐丸由西洋參、山藥、龜板、鹿茸、玉竹、葛根、烏梅、黃芪、麥冬、山萸肉、女貞子、白芍等組成，由黑龍江省中西醫結合研究所制劑室生產；二甲雙胍(北京京豐制藥，批號：H11021518)；高糖高脂飼料由25%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、20%蔗糖、62.5%基礎飼料等組成；鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigma；胰島素ELISA檢測試劑盒、兔抗PI3Kp85和AKT2多克隆抗體，武漢博士德;PCR引物及抽提試劑等均由大連寶生物提供。

1.3 儀器

2135型組織切片機，德國菜卡；Moticam3000顯微攝影成像系統，美國Motic； DNM-9602型酶標儀，北京普朗新技術有限公司；熒光定量PCR，美國ABI。

2 方法

2.1 模型制備及分組給藥

實驗前檢測大鼠全血血糖，剔除血糖異常者，再隨機分為正常組(10只)和高糖高脂喂養組(60只)，分別予以普通飼料和高糖高脂飼料喂養8周。高糖高脂組大鼠禁食禁水12 h后，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液，連續觀察3 d。篩選空腹血糖≥16.7 mmol/L者為模型制備成功。將造模成功大鼠再隨機分為模型組、二甲雙胍組，御唐丸低、中、高劑量組，繼續喂以高脂飼料。二甲雙胍組灌胃給予濃度為0.2 g/kg的二甲雙胍混懸液；御唐丸低、中、高劑量組分別灌胃給予濃度為 0.675、1.35、2.70 g/kg的御唐丸混懸液；正常組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。干預4周后處死大鼠，留取血清及肝臟組織。

2.2 指標檢測

2.2.1 大鼠空腹血糖(FBG)測定

大鼠尾尖取血，采用微量血糖測定儀進行檢測，分別于造模前、造模后和治療后進行監測大鼠FBG變化。

2.2.2 大鼠空腹血清胰島素(FINS)測定

各組大鼠在末次給藥后禁食禁水12 h，取血分離血清，嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。

2.2.3 胰島素敏感系數(ISI)的測定

根據公式對各組大鼠ISI進行分析[7]，ISI=Ln[1/(FINS×FBG)]，即FBG與FINS乘積倒數的自然對數。

2.2.4 免疫組化法檢測肝臟PI3Kp85a、AKT2蛋白表達

肝臟組織經常規石蠟包埋后切片，PV二步法檢測PI3Kp85a、AKT2蛋白表達。Moticam3000顯微攝影成像系統在400倍視野下攝影，每組每例隨機選取3不同視野，采用Motic image 3.2圖像分析軟件進行分析，以平均灰度值代表蛋白含量的多少。

2.2.5 RT-PCR法檢測PI3Kp85a、AKT2mRNA表達

液氮凍存的肝組織經研磨后，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測PI3Kp85a、AKT2mRNA表達。見表1。

表1 引物序列表

2.3 統計學分析

3 結果

3.1 對大鼠空腹血糖(FBG)的影響

造模后各大鼠FBG顯著升高，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；治療后各治療組FBG均有不同程度的降低，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)，其中以御唐丸高劑量組降低最為明顯。見表2。

表2 各組大鼠FBG比較

3.2 對大鼠空腹血清胰島素(FINS)的影

與空白組相比較，模型組FINS水平明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠FINS均有不同程度的升高，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表3。

表3 各組大鼠FINS比較

3.3 對大鼠胰島素敏感系數(ISI)的影響

模型組大鼠胰島素敏感系數明顯降低，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠胰島素敏感系數均有不同程度的升高，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表4。

表4 各組大鼠ISI比較

3.4 對大鼠肝臟PI3Kp85a、AKT2蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，PI3Kp85a、AKT2蛋白主要表達在肝細胞胞質中，陽性表達呈黃色或棕黃色顆粒狀。模型組大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2蛋白相對含量明顯減少，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2蛋白相對含量均有不同程度的增加，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.05或0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表5。

表5 PI3Kp85a、AKT2免疫組織化學染色平均灰度值比較

3.5 對大鼠PI3Kp85a、AKT2mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，模型組大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2mRNA表達明顯減少，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2mRNA表達量均有不同程度的增加，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見表5。

表5 治療后各組大鼠PI3Kp85amRNA、AKT2mRNA表達

4 討論

現代醫學研究表明，糖尿病及其并發癥發生發展的病理基礎是機體內糖脂代謝障礙[8-9]，不良的飲食習慣和生活方式是誘發糖尿病發病率逐年上升的重要原因，由于過量攝入高糖高脂食物，使機體脂質代謝紊亂，導致胰島抵抗(IR)的發生[10]。IR是指機體中胰島素的生理效應降低，或各種原因引起的組織對胰島素反應能力下降。本實驗采用高糖高脂飼料結合STZ誘導大鼠糖尿病模型，模擬人類2型糖尿病IR的病理過程，結果顯示FBG水平明顯升高，FINS水平明顯降低，胰島素敏感系數明顯降低，表明此方法制備的大鼠2型糖尿病模型產生了明顯的胰島素抵抗。經御唐丸治療后，FBG水平有不同程度的降低，FINS水平也有不同程度的升高，胰島素敏感系數明為增強，表明御唐丸對胰島素抵抗具有顯著的改善作用。

胰島素必須與相應的受體結合后，激活相關的級聯酶促反應，產生一系列的細胞內信號轉導，才能最終發揮其生理效應[11]，其中PI3K/AKT信號途徑是調控胰島素水平的主要信號通路之一。正常情況下，胰島素與其受體結合后，活化酪氨酸激酶產生自磷酸化，進而促進SH2與PI3Kp85結合并活化PI3K ，經過一系列催化過程激活AKT，激活的 AKT使下游的GSK-3β磷酸化，肝臟中肝糖原的合成增加，維持機體血糖的正常水平[12-13]。糖尿病時胰島素抵抗狀態下，胰島素水平或者效能不足，GSK -3β磷酸化減少，使肝糖原含量下降，導致體內血糖水平升高[14]。本實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表達量均顯著下調，御唐丸低、中、高劑量組大鼠肝組織中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表達量均有不同程度的上調。提示御唐丸可以通過激活 PI3K/Akt 信號通路，改善糖尿病大鼠胰島素抵抗狀態，進而發揮治療糖尿病的作用。