Cornulin在黑素瘤和痣細胞痣中的表達及意義

甄愛華，陳敬德，李 霞，張 莉，戴偉平，李昌吉

（酒泉市人民醫院，甘肅 酒泉 735000）

Cornulin蛋白是S100蛋白中的一員，在N端有一鈣結合位點[1]。另一項研究表明，Cornulin基因是融合基因中的一員，可能在表皮分化中起著重要的作用[2]。雖然Cornulin基因在ESCC中表達下調，很可能在正常組織向腫瘤組織轉變中丟失[3]，但Cornulin蛋白表達情況及其與臨床病理特征和5年生存率之間的關系無相關研究。黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，多發生于皮膚，占皮膚惡性腫瘤的第三位（占6.8%～20%）[4]，其惡性程度高，極易發生潰瘍和轉移，死亡率占皮膚癌死亡人數的70%[5]。統計顯示，在全球范圍內，黑素瘤的發病率正在逐年上升[6]，不僅給患者本人帶來極大的痛苦，也造成很大的經濟負擔。而極少數的痣細胞痣有惡變為黑素瘤的可能。因此，研究Cornulin在黑素瘤發病中的機制，對探索新的靶向治療措施有重要意義。我們采用免疫組化方法分析了痣細胞痣、黑素瘤中Cornulin的表達，以探討其在這兩種疾病發生、發展中所起的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2010年7月至2016年7月甘肅酒泉市人民醫院皮膚科病理室診斷為痣細胞痣患者的蠟塊38例和黑素瘤患者的蠟塊42例（無其他皮膚病或系統性疾病）。痣細胞痣中，男15例，女23例，年齡14～61歲，平均41.3歲；黑素瘤中，男17例，女25例，年齡14～88歲，平均51.3歲。另選用美容科美容手術切除的正常皮膚組織32例作為對照組，其中男15例，女17例；年齡19～63歲，平均38.6歲。患者性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑

兔免疫組化試劑盒及DBA酶底物試劑盒（購自北京中衫金橋生物技術有限公司）、Cornulin兔抗人單克隆抗體（購自CellSignaling Technology公司），抗體工作濃度為 1∶100。

1.3 方法

新鮮組織常規固定包埋，切片常規脫蠟、水化后用0.25%高錳酸鉀20 min、5%草酸1 min，以脫去黑色素；3%雙氧水孵育10 min，以去除組織內固有的過氧化物酶；枸櫞酸緩沖液進行抗原修復：92℃水浴5 min，自然冷卻；山羊血清封閉液室溫孵育15 min，以去除非特異性染色。一抗4℃結合置于冰箱過夜，二抗37℃孵育15 min，辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素37℃孵育15 min，DAB染色，蘇木素復染，陰性對照用枸櫞酸緩沖液代替一抗或二抗。

1.4 觀察指標

1.4.1 觀察內容 Cornulin陽性表達為細胞質和（或）細胞核內出現黃色、棕黃色或褐色顆粒。

1.4.2 評價標準 在400倍鏡下隨機選取10個視野，觀察細胞染色的強度，計算陽性細胞百分率。

腫瘤細胞陽性率＜5%為0分，5%～25%為1，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；根據染色強度分為4級，無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個視野陽性細胞百分率與染色強度相乘為該視野得分，最終得分為10個視野得分的平均值。0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件，用χ2檢驗對各組Cornulin表達的陽性率進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Cornulin 在正常皮膚組織、痣細胞痣及黑素瘤中的表達情況

免疫組化顯示，在32例正常皮膚組織，Cornulin弱表達于表皮基底層，陽性率為56.25%（18/32），見圖1；在38例痣細胞痣患者的皮損中，Cornulin表達于靠近表皮的部分痣細胞和真皮內的痣細胞，陽性率為52.63%（20/38），見圖2；在42例黑素瘤患者的皮損中，Cornulin表達于幾乎所有的瘤細胞中，陽性率為 92.86%（39/42），見圖 3。

2.2 Cornulin在痣細胞痣、黑素瘤及正常皮膚組織中的表達情況

在38例痣細胞痣患者皮損中的Cornulin與正常皮膚表皮相比，差異無統計學意義（χ2=2.454，P＞0.05）；在 42 例黑素瘤患者皮損中的Cornulin表達與正常皮膚表皮相比，差異具有統計學意義（χ2=21.644，P＜0.001），與痣細胞痣相比，差異具有統計學意義（χ2=20.722，P＜0.001），見表 1。

圖1 Cornulin在正常皮膚組織中的表達（SP×200）

圖2 Cornulin在痣細胞痣中的表達（SP×200）

圖3 Cornulin在黑素瘤中的表達（SP×200）

表1 Cornulin在正常皮膚組織、痣細胞痣和黑素瘤中的表達

3 討論

3.1 Cornulin研究現狀

Cornulin也稱C1orf10和SEP53，最初是Xu等[7]于2000年在食管上皮細胞中應用改良的分化顯示PCR方法發現的。由于Cornulin在熱休克后合成明顯增多，并且編碼了一個分子量53 kDa的鈣結合蛋白，故Yagui-Beltran等[8]于2001年又稱C1orf10為SEP53。C1orf10產物是蛋白質，并且它的結構特征與表皮分化復合體的融合基因家族成員相似，在表皮分化中起作用，故Contzler稱之為Cornulin[2]。Cornulin是分子量為53kDa編碼495個氨基酸，且它的N末端有約90個殘基的鈣結合基序和60個氨基酸的保守連續重復序列，Cornulin是編碼在表皮分化復合體的1q21染色體上，主要定位在細胞質和核周區[2-3]。除食管上皮細胞外[2-3，9]，口腔鱗狀上皮細胞[10-11]、宮頸鱗狀上皮細胞[12]、表皮鱗狀上皮細胞[13]、瞼板腺上皮細胞和甲狀腺濾泡等也被鑒定出了Cornulin。除在鱗狀細胞腫瘤如食管上皮細胞瘤[2]、口腔上皮細胞瘤[10-11]、宮頸鱗狀上皮細胞[12]、頭頸部上皮細胞瘤[14]，還有甲狀腺癌和濕疹等的Cornulin表達也降低。

3.2 Cornulin在黑素瘤中的表達高于正常組織

黑素瘤是來源于黑素細胞、惡性程度較高的惡性腫瘤，部分患者可由痣細胞痣演變而來[4]。我們的實驗表明，Cornulin在皮膚黑素瘤中的表達顯著高于正常皮膚組織及痣細胞痣（P＜0.001），在痣細胞痣中的表達雖然高于正常皮膚組織，但二者的差異無統計學意義（P＞0.05），說明其在上述皮膚病中起一定作用。隨著黑素細胞不典型分化程度的增加及病變范圍的擴大，Cornulin表達呈上升趨勢，可能在腫瘤惡性程度的增加及疾病進展過程中發揮一定作用，然而具體機制尚不完全清楚。Cornulin能否作為判斷皮膚黑素瘤浸潤程度及預后的指標，尚需進一步研究。