紫蘇籽低聚肽中營養及特征成分研究

王雨晴，姜盛，郭穎，董哲，王雨辰，畢園，陳亮，谷瑞增*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心, 北京，100015) 2(華狐生物科技(中國)有限公司，遼寧 沈陽，110000)

紫蘇籽(PerillafrutescensL. Britt.)是藥食兩用原料，是國家衛生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種物品之一，利用價值高，其提取物有護肝、止咳、抗氧化等功效[1-3]，在中國已有幾千年使用歷史。

紫蘇籽因其油脂含量高且不飽和脂肪酸含量高，常被用于提取油脂，而紫蘇籽提油后的紫蘇籽粕中蛋白質含量接近40%且雜質少[4-5]，是良好的蛋白質來源。紫蘇籽蛋白的高值化利用正在成為國內外食品和保健品領域的研究熱點。目前紫蘇籽蛋白的研究多圍繞蛋白提取工藝、低聚肽的制備和分離等方面。紫蘇籽低聚肽是從紫蘇籽粕提取的蛋白經過酶解技術獲得的小分子肽類物質，逐漸引起研究領域的關注。

對于紫蘇籽低聚肽的功能，目前有一定的研究基礎。童波等利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解紫蘇粕制備高F值低聚肽[6]，但并未對其具體結構進行說明。YANG等從紫蘇籽蛋白水解物中分離鑒定出了2個具有抗氧化活性的二肽結構，分別為Tyr-Leu和Phe-Tyr[7]。姜文鑫等以紫蘇分離蛋白為原料，通過堿性蛋白酶(alcalase)水解制備了紫蘇抗菌肽[8]。賀東亮從紫蘇蛋白水解物中鑒定出了序列為 Ala-Ser-Pro-Gly-Leu-Trp-Ser的七肽，并驗證其具有抗腫瘤活性[9]。KIM等從紫蘇籽蛋白水解物中提取了1個具有抗氧化活性的十一肽，序列結構為Ile-Ser-Pro-Arg-Ile-Leu-Ser-Tyr-Asn-Leu-Arg[10]。

本研究以紫蘇籽蛋白為原料，經酶解提純，制得紫蘇籽低聚肽。通過對蛋白及低聚肽含量、分子質量分布、氨基酸組成和特征肽段的分析，考察紫蘇籽低聚肽的營養成分及特征性成分，為紫蘇籽低聚肽的產品開發和市場應用提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽蛋白,華狐生物科技(中國)有限公司提供。

低聚肽標準品甘氨酰精氨酸二肽(glycyl-arginine，GR)和丙氨酰精氨酸二肽(alanyl-arginine,AR)(純度均≥99%)，蘇州強耀生物科技有限公司；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，迪馬科技；實驗用超純水(18.2 MΩ·cm)，由Milli-Q純水系統制備。

1.2 儀器與設備

色譜儀Nexera X2與三重四極桿質譜儀聯用系統(LCMS-8060，配有LabSolutions Ver. 5.91色譜工作站)，日本島津公司；分析天平(XS205DU)，美國Mettler Toledo公司；旋渦混合儀(QL-901)，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗樣品制備

在pH(7.5±0.2)、(52±2) ℃條件下用復合蛋白酶酶解紫蘇籽蛋白4 h，經(115±5) ℃滅酶、離心、過濾、濃縮、噴霧干燥后制得紫蘇低聚肽樣品。

1.3.2 蛋白質及肽含量測定

總蛋白含量采用GB 5009.5—2010規定的方法測定[11]，蛋白質換算系數為6.25；參考GB/T 22729—2008測定酸溶蛋白和低聚肽含量[12]。

1.3.3 相對分子質量分布

參照GB/T 22729—2008中6.3，采用高效凝膠過濾色譜法進行測定[12]。

標準品制備：用流動將相配制1 mg/mL的樣品溶液。

樣品制備：用流動相配制1 mg/mL的樣品溶液，經孔徑0.2 μm 聚四氟乙烯過濾膜過濾后待測。

色譜條件：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶54.9∶0.1，流速0.5 mL/min；進樣體積10 μL；檢測波長220 nm；柱溫30 ℃。

數據處理：使用GPC軟件處理色譜數據，以相對分子質量的對數(lgMW)對保留時間作圖得到相對分子質量校正曲線及方程，將樣品的色譜數據代入校正曲線方程計算樣品中肽的相對分子質量及其分布范圍。用峰面積歸一化計算不同分子質量范圍的峰面積相對百分比之和。

1.3.4 氨基酸組成

參考GB 5009.124—2016第一法，氨基酸自動儀進行分析[13]。

1.3.5 低聚肽結構的測定

低聚肽結構的測定利用超快速液相色譜串聯三重四極桿質譜方法測定。

樣品處理：用純水將樣品稀釋100倍，離心處理后(10 000 r/min離心10 min)取上清液，用孔徑為0.22 μm尼龍過濾膜過濾后，制得待測樣品。

液相色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3(5 μm，2.1 mm×250 mm)；流動相：A為0.1% 甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，B 0～50%；15～20 min，B 50%～100%；20～25 min，B 100%；25.1～35 min，B 0%；流速0.2 mL/min；進樣體積10 μL；柱溫40 ℃。質譜條件：離子化模式ESI, 正離子模式；離子噴霧電壓+4.5 kV；霧化氣流速氮氣 3.0 L/min；加熱氣流速氮氣 10 L/min；干燥氣流速氮氣10 L/min；DL溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；離子源溫度300 ℃；掃描模式：多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)；駐留時間100 ms；延遲時間3 ms；MRM參數見表1。

表1 化合物的MRM優化參數Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

1.4 氨基酸的營養價值計算

計算紫蘇籽低聚肽的必需氨基酸質量分數，并分別以FAO/WHO推薦的成人體內的必需氨基酸模式作參比計算氨基酸評分(amino acid score,AAS)，以雞蛋氨基酸模式作參比計算氨基酸化學評分(chemical score,CS)和必需氨基酸指數(essentoal amino acid index,EAAI)。

1.4.1 必需氨基酸質量分數

必需氨基酸與氨基酸總量之比(E/T)按式(1)計算:

(1)

式中：EAA為必需氨基酸的含量，TAA為氨基酸總量。

1.4.2 氨基酸評分

氨基酸評分(AAS)按式(2)計算:

(2)

1.4.3 氨基酸化學評分

氨基酸化學評分(CS)按式(3)計算:

(3)

1.4.4 必需氨基酸指數

必需氨基酸指數(EAAI)按式(4)計算:

(4)

式中：n為所涉及的必需氨基酸數;ai為實驗蛋白質的各種氨基酸含量，%；A為雞蛋蛋白中相應的必需氨基酸含量，%；i=1，2，…，n。

2 結果與分析

2.1 紫蘇籽低聚肽的蛋白質及低聚肽含量

分析表明，紫蘇籽低聚肽的干基蛋白含量為93.14%，干基肽含量為86.35%，說明紫蘇籽低聚肽蛋白含量高，且多以低聚肽的形式存在，是一種較好的蛋白來源。

2.2 紫蘇籽低聚肽的相對分子質量分布

紫蘇籽低聚肽的相對分子質量分布色譜圖如圖1所示。

圖1 分子質量分布色譜圖Fig.1 Chromatograph of molecular weight distribution

紫蘇籽低聚肽為以紫蘇籽蛋白為原料經預處理、酶解、分離等工藝制得，為低聚肽的混合物，分子質量分布結果顯示，低聚肽主要集中在140～1 000 Da，占總比例的82.8%。相對分子質量小于1 000 Da的蛋白水解物，由于含有小分子肽，更容易被人體直接吸收，發揮生理功能[14]。因此紫蘇籽低聚肽中高比例小分子蛋白水解物作為被人體直接吸收的營養物質成分。

2.3 紫蘇籽低聚肽的氨基酸組成

根據方法1.3.3紫蘇籽低聚肽的氨基酸組成及含量如表2所示。

表2 紫蘇籽低聚肽的氨基酸組成及含量Table 2 amino acid profile of perilla seed oligopeptides

由表2可知，組成紫蘇籽低聚肽的氨基酸(色氨酸除外)總量為847.86 mg/g，必需氨基酸含量為230.20 mg/g，占紫蘇籽低聚肽氨基酸總量的27.15%。含量最高的氨基酸是谷氨酸178.90 mg/g，其次是精氨酸102.72 mg/g。谷氨酸在植物源蛋白中占比均較高，而紫蘇籽低聚肽中精氨酸相比其他植物源蛋白質含量較高。

從Uniport蛋白數據庫中檢索到一條紫蘇蛋白序列，如圖2所示。精氨酸(R)約占整條序列的10%，與氨基酸組成中精氨酸含量基本吻合。

圖2 Uniport蛋白數據庫中紫蘇蛋白序列Fig.2 Perilla protein sequence from the Uniport protein database

2.4 紫蘇籽低聚肽的營養價值評價

現在國際上以全雞蛋的必需氨基酸模式，或根據人體所必需的氨基酸量提出的假設模式，作為評價食物蛋白質營養價值的標準。AAS用于評價蛋白質的營養價值，能夠反映食物蛋白質與人體蛋白質構成模式的接近程度[15-16]；CS顯示了被測食物蛋白質與標準蛋白質雞蛋蛋白氨基酸的接近程度；必須氨基酸指數是指待測蛋白質的必需氨基酸含量與標準氨基酸(通常是雞蛋蛋白質)中的必需氨基酸含量比值的幾何平均數，是評價蛋白質營養狀態的一項化學指標。

根據方法1.4折算紫蘇籽低聚肽的氨基酸營養評價分值、化學評分以及必需氨基酸指數，結果見表3所示。

表3 紫蘇籽低聚肽的營養價值評價結果Table 3 Nutritional value of perilla seed oligopeptides

與成人體內的蛋白質必需氨基酸模式相比，除含硫氨基酸(胱氨酸和蛋氨酸)以外，其余氨基酸分值均大于100，說明只有胱氨酸和蛋氨酸是紫蘇籽低聚肽的限制氨基酸。必需氨基酸指數為59.55%，必需氨基酸評分含量最高的是纈氨酸，明顯高于FAO/WHO推薦成人必需氨基酸模式[17]。紫蘇籽低聚肽的氨基酸組成基本符合人體必需氨基酸的構成模式。

2.5 紫蘇籽低聚肽的序列結構

生物活性肽序列在母體蛋白質中沒有生物活性，通過酶解及生物發酵等作用可以被釋放，從而表現出生物活性作用[14,18]。分子質量分布研究結果發現，紫蘇籽低聚肽中相對分子質量小于1 000 Da的肽段所占比例最高，為小分子低聚肽，說明紫蘇籽低聚肽可能具有潛在的生物活性。

肽段的生物活性功能與其氨基酸種類和組成結構有一定的關系。有研究表明，含有精氨酸的低聚肽具有一定活性功能。賈俊強等[19]研究與血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制肽的氨基酸組成情況，結果表明精氨酸是具有ACE抑制功能的特征之一，可能因為精氨酸與ACE活性位點親和力較強，能夠促進多肽與ACE的位點結合。SENTANDREU等研究表明，GR和AR具有ACE抑制活性，從而可能起到降血壓作用[20]。SHIMIZU等從大豆中分離出GR，研究表明GR可以促進小鼠腦中神經營養因子的表達，從而提高與年齡有關的認知能力[21]。

細胞穿膜肽 (cell-penetrating peptides，CPPs) 是一類能夠穿過細胞膜或組織屏障的短肽，精氨酸殘基是大多數細胞滲透肽的所具有的結構，精氨酸的胍基在細胞滲透肽表面提供正電荷，與細胞膜中帶負電荷的羧酸、磷酸基團能夠相互作用形成氫鍵，從而穿過細胞膜進入細胞[22]。另有研究證實含有精氨酸殘基的細胞滲透肽可以作為分子載體[23]。

氨基酸組成結果表明，紫蘇籽低聚肽中精氨酸含量較高。含有精氨酸的肽段可能具有較好的生物功能活性，并且是潛在細胞滲透肽和分子載體。本實驗進一步對低聚肽中部分含有精氨酸的肽段序列進行分析。結果表明，紫蘇籽低聚肽中含有GR和AR兩條二肽序列，色譜圖如圖3所示，含量分別為78.4 mg/kg和445.1 mg/kg，Uniport蛋白數據庫顯示有該二肽存在于紫蘇蛋白中(圖2中綠色和黃色突出顯示)。與其他3種植物源低聚肽比較，紫蘇籽低聚肽中含量均為最高，結果見表4。目前尚未有從紫蘇籽低聚肽中鑒定出上述2條序列的報道。

表4 植物源低聚肽中GR和AR含量比較Table 4 Comparison of GR and AR content in plant-derived oligopeptides

圖3 紫蘇籽低聚肽中GR和AR的定量色譜圖Fig.3 Quantification chromatograph of GR and AR in perilla seed oligopeptides

3 結論

紫蘇籽低聚肽蛋白含量高，且多以低聚肽的形式存在，分子質量主要分布在140～1 000 Da，是一種較好的蛋白來源。有較高的氨基酸評分，是一種優質的蛋白來源。精氨酸含量高達102.72 mg/g。胱氨酸和蛋氨酸是紫蘇籽低聚肽的限制氨基酸。必需氨基酸指數為59.55%，氨基酸組成基本符合人體必需氨基酸的構成模式。

從紫蘇籽低聚肽中鑒定出了2條C端為精氨酸殘基的二肽GR和AR，其中GR已被證實可以促進小鼠腦中神經營養因子的表達，從而提高與年齡有關的認知能力，GR和AR均具有ACE抑制活性，兩者均含有精氨酸殘基，可能為細胞穿膜肽，并有作為分子載體的潛力，在吸收利用方面有潛在的優勢。這2條二肽序列均為國內外首次從紫蘇籽低聚肽中鑒定出，更多的生物活性成分還有待進一步挖掘。

相比于化學合成，天然物質產生的活性肽應用于功能食品和保健食品中更為安全。本研究通過對紫蘇籽低聚肽的營養及特性成分進行分析，為紫蘇粕及紫蘇蛋白的開發利用提供了理論依據。