番茄紅素合成基因組合優(yōu)化和產(chǎn)物測定

周親親，徐沙，周景文*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

番茄紅素是一種抗氧化活性較強(qiáng)的天然色素，其單態(tài)氧淬滅速率是β-胡蘿卜素的2倍[1]，能有效清除自由基，延緩細(xì)胞衰老，對預(yù)防前列腺癌、肺癌及心血管疾病等有顯著作用[2-3]，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、保健食品與化妝品等行業(yè)。目前因植物提取法存在提取率低、純度低等問題、化學(xué)合成法存在手性基團(tuán)無法控制、得率低等缺點(diǎn)，番茄紅素的工業(yè)生產(chǎn)受到一定限制。而目前天然微生物合成法在發(fā)酵過程中為了阻斷從番茄紅素到β-胡蘿卜素的合成反應(yīng)，需要添加阻斷劑，導(dǎo)致番茄紅素產(chǎn)量和純度較低[4]。隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，改造模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母構(gòu)建高效細(xì)胞工廠已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[5-7]。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,S.cerevisiae)是公認(rèn)為安全無毒(generally recognized as safe,GRAS)的真核模式微生物，已成功被改造用于生產(chǎn)青蒿酸[8]、次丹參醌[9]、白藜蘆醇[10]以及人參皂苷[11]等多種天然產(chǎn)物。相對大腸桿菌，釀酒酵母具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾且不含內(nèi)毒素，以其作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)番茄紅素具有較大競爭力。釀酒酵母本身存在萜類化合物合成的通用途徑即甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway, MVA pathway)[12]，萜類化合物構(gòu)成的基本單元為異戊烯焦磷酸(isopentenyldiphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)。這2個基本單元在法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)依次催化下，得到番茄紅素合成前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)。八氫番茄紅素合酶(phytoene synthase,CrtB)將2分子GGPP縮合成八氫番茄紅素(phytoene)，在外源八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene denydrogenase，CrtI)作用下連續(xù)四步脫氫分別合成六氫番茄紅素(phytofluene)、β-胡蘿卜素(β-carotene)、鏈孢霉素(neurosporene)和最終產(chǎn)物番茄紅素[13]。

本研究所選擇的宿主釀酒酵母中，只需外源表達(dá)CrtE、CrtB和CrtI就能得到目標(biāo)產(chǎn)物番茄紅素。然而這3個酶來源分布廣泛，包括噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)等細(xì)菌、三孢布拉氏霉菌等真菌、番茄、西瓜等植物和藻類。不同物種來源的酶的催化活性往往有很大差異[14-16]，因此篩選不同來源的路徑基因進(jìn)行組合，根據(jù)產(chǎn)量確定最佳組合，提高番茄紅素合成途徑通量可能是有效的手段。另一方面，由于目前文獻(xiàn)報道的番茄紅素的檢測方法分析時間長、不易定量[17]、需要價格昂貴的標(biāo)準(zhǔn)品[18]等缺點(diǎn)，需要建立一種適用于實(shí)驗(yàn)室范圍的快速穩(wěn)定的測定方法。綜上，本研究首先分別在乙醇脫氫酶系(adh2、adh3、adh4)基因位點(diǎn)整合3個拷貝數(shù)的不同來源CrtE基因強(qiáng)化GGPP供給，構(gòu)建不同來源CrtB、CrtI的組合游離表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化上述GGPP供給強(qiáng)化的突變株，然后篩選番茄紅素合成基因組合，同時建立了一種酶標(biāo)儀快速測定番茄紅素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

菌株：大腸感受態(tài)EscherichiacoliJM109(E.coliJM109)、釀酒酵母宿主菌YPH499△gal80，實(shí)驗(yàn)室保藏。

質(zhì)粒：pMD19-T載體，用于TA克隆,Takara公司；酵母表達(dá)載體pY26-GPD-TEF、大腸表達(dá)載體pET28(a)+、酵母CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)質(zhì)粒302、149、BTS、Cas9載體，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 工具酶、試劑及培養(yǎng)基

Taq mix DNA聚合酶，BIO SCI寶賽生物公司；DNA連接酶，Takara公司；限制性內(nèi)切酶(BamH I、BglII、EcoR I、NcoI、NheI、NotI)，Thermo Scientific公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Axygen公司；氨芐青霉素，上海生工生物工程有限公司；G418、潮霉素(hygromycin B，Hyg)、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物有限公司；硫酸諾爾斯菌素(nourseothricin，Nour)，上海愍康生物科技有限公司；天然β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，麥克林；甲苯、三氯甲烷、丙酮、正己烷、二氯甲烷、石油醚、2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene,BHT)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷,用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測，阿拉丁aladdin；玻璃珠(0.5 mm)，Sigma Aldrich公司。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基(酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉)用于大腸桿菌的培養(yǎng)；YPD培養(yǎng)基(酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、無水葡萄糖20 g/L，固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂粉)用于釀酒酵母的培養(yǎng)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀、小型臺式高速離心機(jī),Eppendorf公司；凝膠成像儀,BIO-RAD公司；UV-3200分光光度計(jì),MAPADA公司；SPARK多功能酶標(biāo)儀,Tecan公司；高效液相色譜儀-示差檢測器,Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同來源CrtE、CrtB、CrtI基因的異源表達(dá)

本研究合成異源基因查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，根據(jù)宿主菌釀酒酵母進(jìn)行密碼子優(yōu)化后由金唯智(蘇州)公司合成保存在pUC57質(zhì)粒上(命名為pUC57-CrtE、pUC57-CrtB、pUC57-CrtI)。本研究所用到的菌株、基因和引物如表1～表3所示。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in this work

表2 本研究所用的基因Table 2 Gens used in this work

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

番茄紅素表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建：首先以pY26-GPD-TEF質(zhì)粒為模板，用引物PY26-F、PY26-R反向擴(kuò)增，NcoI/NheI雙酶切后純化得pY26載體片段；同時以含kan基因質(zhì)粒pET28(a)+為模板，用引物Kan-F、Kan-R擴(kuò)增，NcoI/NheI雙酶切后純化得kan基因，將二者所得產(chǎn)物16 ℃連接6 h后轉(zhuǎn)化E.coliJM109，菌落PCR驗(yàn)證正確后測序確認(rèn)。然后將質(zhì)粒醋酸鋰轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499△gal80，涂布于YPD(添加500 mg/L G418)平板上30 ℃倒置培養(yǎng)，2～3 d后平板上長出轉(zhuǎn)化子表明kan抗性基因的功能性存在，成功將原始pY26-GPD-TEF質(zhì)粒的篩選標(biāo)記替換為KanMX，命名為pY26-kan，作為番茄紅素合成基因表達(dá)的骨架質(zhì)粒。接著BglII/NotI雙酶切pUC57-CrtI、pY26-kan質(zhì)粒后，純化產(chǎn)物并16 ℃連接6 h后轉(zhuǎn)化E.coliJM109，菌落PCR驗(yàn)證正確后測序確認(rèn)(pY26-CrtI)。最后BamH I/EcoR I雙酶切pUC57-CrtB、pY26-CrtI質(zhì)粒后，純化產(chǎn)物并連接轉(zhuǎn)化E.coliJM109，菌落PCR驗(yàn)證后測序確認(rèn)，構(gòu)建pY26-McCrtB-BtCrtI等16個不同組合的番茄紅素表達(dá)質(zhì)粒(表4)。

表3 本研究所用到的引物Table 3 Primers used in this work

續(xù)表3

表4 本研究所用的質(zhì)粒Table 4 Plasmids used in this work

模塊整合質(zhì)粒構(gòu)建：以pUC57-AtCrtE為模板，擴(kuò)增出兩端帶有adh2 up(adh2基因起始密碼子上游50 bp)和adh2 down(adh2 基因終止密碼子下游50 bp)的片段連接pMD19-T，命名為Module1；其他模塊類似方法構(gòu)建并命名。

釀酒酵母CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建：以302質(zhì)粒為模板，用gRNA302bp-F/gRNA302bp(ADH2)-R引物擴(kuò)增得到302 bp片段；同時以149質(zhì)粒為模板gRNA149bp(ADH2)-F/gRNA149bp-R引物擴(kuò)增得到149 bp片段；再以302 bp和149 bp片段為模板，用gRNA302bp-F/gRNA149bp-R融合PCR得到472 bp片段后BamH I/BcuI雙酶切純化；sgRNA骨架質(zhì)粒BTSBamH I/BcuI雙酶切純化，將2個純化產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化E.coliJM109。菌落PCR驗(yàn)證正確后測序確認(rèn)，命名為gRNA-ADH2。并用相同方法構(gòu)建adh3、adh4位點(diǎn)sgRNA質(zhì)粒。

1.2.3 模塊整合基因組和轉(zhuǎn)化子篩選

在上述3個GGPP強(qiáng)化供給的工程菌中分別轉(zhuǎn)入16個不同組合的番茄紅素游離表達(dá)質(zhì)粒，在YPD-G418平板上30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，直至長出單菌落，根據(jù)顏色鑒別篩選出顏色較深的工程菌。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵

將篩選到的工程菌接種到添加500 mg/L YPD液體培養(yǎng)基中30 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h制備種子液，檢測OD600。以最終OD600=0.5轉(zhuǎn)接至含50 mL YPD液體培養(yǎng)基(添加500 mg/L G418)的三角瓶中，30 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h檢測中間過程生長OD600、細(xì)胞干重及最終產(chǎn)物含量。

1.2.5 番茄紅素快速檢測方法的探究

不同溶劑中番茄紅素和β-胡蘿卜素的吸收圖譜：取10個小燒杯，分別稱取5份1 mg番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品和5份1 mg β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，加入小燒杯中，分別用甲苯、三氯甲烷、丙酮、正己烷、含2%(體積分?jǐn)?shù))二氯甲烷的石油醚溶解倒入25 mL的容量瓶中，定容后配成不同溶劑下的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液和β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液。用分光光度計(jì)在400～600 nm范圍內(nèi)掃描吸收值。

正己烷中番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品1.25 mg，加入燒杯中用正己烷溶解后倒入25 mL容量瓶中，定容后配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋成0.01、0.02、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40和45 mg/L不同濃度的稀釋液。以正己烷作為空白對照，分別吸取200 μL至96孔酶標(biāo)板，在最大吸收波長472 nm處測定吸光值。每個濃度樣品重復(fù)3個平行樣，室溫測得吸光值后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定檢測限。

1.2.6 番茄紅素提取與檢測

加大監(jiān)管力度，規(guī)范生產(chǎn)經(jīng)營行為。濮陽市局扎實(shí)推進(jìn)執(zhí)法監(jiān)管“一制兩化”（即落實(shí)監(jiān)管責(zé)任制，推進(jìn)執(zhí)法監(jiān)管規(guī)范化、法治化），實(shí)行網(wǎng)格化、痕跡化監(jiān)管，著力提升執(zhí)法監(jiān)管水平。注重加強(qiáng)行刑銜接，成立了行刑銜接工作領(lǐng)導(dǎo)小組，健全了聯(lián)席會議、案件備案回復(fù)和案件復(fù)查等工作機(jī)制。

胞內(nèi)番茄紅素含量的檢測：取6管發(fā)酵液，每管取收集1.5 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心3 min，無菌水清洗后，加適量體積的玻璃珠和1 mL提取液(含10 g/L BHT的丙酮)，振蕩破碎3 min，冰浴1 min，重復(fù)5次，12 000 r/min離心10 min，取上清液；再加入1 mL提取液提取后將6管所得的上清液合并；上清液用液氮吹干后，用正己烷溶解并用0.22 μm有機(jī)膜過濾，用酶標(biāo)儀檢測OD472。

HPLC檢測：以Waters Xbridge BEH C18為色譜柱(150 mm×2.1 mm 3 μm)，V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=21∶21∶8為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長472 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)化前體供應(yīng)工程菌的構(gòu)建和生產(chǎn)番茄紅素釀酒酵母細(xì)胞的初篩

本研究分別選取不同物種(植物、真菌、細(xì)菌)來源的3種CrtE、4種CrtB和4種CrtI進(jìn)行密碼子優(yōu)化，來源包括模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana, At)、曼地亞紅豆杉、番茄(Solanumlycopersicum, Sl)、葫蘆科苦瓜屬的木鱉果(Momordicacochinchinensis, Mc)、苦瓜(Momordicacharantiasubsp.Charantia, Mc)、成團(tuán)泛菌、三孢布拉氏霉菌、紅法夫酵母。用CRISPR-Cas9的方法分別在宿主菌YPH499△gal80中乙醇脫氫酶系的adh2、adh3、adh4基因的開放閱讀框(open reading frame, ORF)整合3個拷貝數(shù)的AtCrtE、PaCrtE和TmCrtE，陽性克隆經(jīng)過特異性引物驗(yàn)證后(圖1)，得到前體強(qiáng)化菌499-3AtCrtE、499-3PaCrtE和499-3TmCrtE。菌落PCR驗(yàn)證引物JP-ADH2F、JP-ADH3F、JP-ADH4F分別在adh2、adh3、adh4基因位點(diǎn)上游300 bp左右，JP-AR、JP-PR、JP-TR在整合基因AtCrtE、PaCrtE和TmCrtE300 bp左右。

雙基因表達(dá)質(zhì)粒pY26-kan的基礎(chǔ)上，將McCrtB、PaCrtB、SlCrtB、XdCrtB、BtCrtI、McCrtI、SlCrtI和XdCrtI進(jìn)行組合得到16個番茄紅素表達(dá)質(zhì)粒(表4)，分別轉(zhuǎn)入499-3AtCrtE、499-3PaCrtE和499-3TmCrtE這3株強(qiáng)化GGPP供應(yīng)的重組菌中，轉(zhuǎn)化后涂布G418平板，形成48株重組菌，結(jié)果如圖2所示。通過觀察顏色發(fā)現(xiàn)，相比較宿主菌YPH499△gal80，有9株菌有顏色(AtE-PaB-BtI、PaE-PaB-BtI、PaE-McB-BtI、PaE-XdB-BtI、PaE-XdB-XdI、TmE-PaB-BtI、TmE-PaB-XdI、TmE-XdB-BtI和TmE-XdB-XdI)，其余菌均為白色，其中499-3TmCrtE轉(zhuǎn)入pY26-PaCrtB-BtCrtI質(zhì)粒的重組菌(命名為TmE-PaB-BtI)顏色較深,最終篩選得到1株最優(yōu)組合的菌株，即TmCrtE、PaCrtB、BtCrtI。

CrtE所編碼的GGPPS是番茄紅素合成路徑中的關(guān)鍵限速酶，由圖2-b、2-c、2-g可知，當(dāng)轉(zhuǎn)入相同質(zhì)粒pY26-PaCrtB-BtCrt時，含TmCrtE菌株顏色最深，含PaCrtE菌株次之，含AtCrtE菌株顏色最淺。由圖2-c和2-d可知，木鱉果McCrtB和三孢布拉霉氏菌來源BtCrtI組合后菌體呈淺黃色，而成團(tuán)泛菌PaCrtB和BtCrtI組合后菌體呈淺黃色但較前者深，因此木鱉果來源McCrtB在釀酒酵母中表達(dá)并不是一個好的選擇。由圖2-g～2-j可知，PaB-BtI、XdB-BtI、XdB-XdI 3個組合的菌顏色都較深。

a-工程菌499-3AtCrtE;b-工程菌499-3PaCrtE;c-工程菌499-3TmCrtE圖1 工程菌499-3AtCrtE、499-3PaCrtE和499-3TmCrtE的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR verification of strains 499-3AtCrtE, 499-3PaCrtE and 499-3TmCrtE注：a圖中， M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1，2，3為YPH499△gal80陰性對照的PCR產(chǎn)物；泳道4，5，6為499-3AtCrtE的PCR產(chǎn)物。引物JP-ADH2F/JP-AR用于驗(yàn)證AtCrtE基因在adh2位點(diǎn)的整合(泳道1和4)，引物JP-ADH3F/JP-AR用于驗(yàn)證AtCrtE基因在adh3位點(diǎn)的整合(泳道2和5)，引物JP-ADH4F/JP-AR用于驗(yàn)證AtCrtE基因在adh4位點(diǎn)的整合(泳道3和6)。b圖中， M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1，2，3為YPH499△gal80陰性對照的PCR產(chǎn)物；泳道4，5，6為499-3PaCrtE的PCR產(chǎn)物。引物JP-ADH2F/JP-PR用于驗(yàn)證PaCrtE基因在adh2位點(diǎn)的整合(泳道1和4)，引物JP-ADH3F/JP-PR用于驗(yàn)證PaCrtE基因在adh3位點(diǎn)的整合(泳道2和5)，引物JP-ADH4F/JP-PR用于驗(yàn)證PaCrtE基因在adh4位點(diǎn)的整合(泳道3和6)。c圖中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1，2，3為YPH499△gal80陰性對照的PCR產(chǎn)物；泳道4，5，6為499-3TmCrtE的PCR產(chǎn)物。引物JP-ADH2F/JP-TR用于驗(yàn)證TmCrtE基因在adh2位點(diǎn)的整合(泳道1和4)，引物JP-ADH3F/JP-TR用于驗(yàn)證TmCrtE基因在adh3位點(diǎn)的整合(泳道2和5)，引物JP-ADH4F/JP-TR用于驗(yàn)證TmCrtE基因在adh4位點(diǎn)的整合(泳道3和6)

a-YPH499△gal80;b-AtE-PaB-BtI：499-3AtCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-PaCrtB-BtCrtI;c-PaE-PaB-BtI：499-3PaCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-PaCrtB-BtCrtI;d-PaE-McB-BtI：499-3PaCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-McCrtB-BtCrtI;e-PaE-XdB-BtI：499-3PaCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-XdCrtB-BtCrtI;f-PaE-XdB-XdI：499-3PaCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-XdCrtB-XdCrtI；g- TmE-PaB-BtI：499-3TmCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-PaCrtB-BtCrtI；h-TmE-PaB-XdI：499-3TmCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-PaCrtB-XdCrtI;i-TmE-XdB-BtI：499-3TmCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-XdCrtB-BtCrtI;j-TmE-XdB-XdI：499-3TmCrtE轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pY26-XdCrtB-XdCrtI圖2 釀酒酵母番茄紅素重組菌初篩Fig.2 Preliminary screening of S.cerevisiae lycopene production recombinant strains

2.2 番茄紅素和β-胡蘿卜素在不同溶劑中的吸收圖譜

番茄紅素和β-胡蘿卜素由于獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)(共軛雙鍵)，在可見光范圍內(nèi)均有吸收。番茄紅素是一種多不飽和脂肪烴，極性較低，基本不溶于水，在多元醇(乙醇、甘油、丙二醇)中難溶，易溶于油脂溶劑中。番茄紅素和β-胡蘿卜素在甲苯、三氯甲烷、丙酮、正己烷及含2%(體積分?jǐn)?shù))二氯甲烷的石油醚不同溶劑中的吸收圖譜如圖3所示。

由圖3可知，番茄紅素在5種不同的溶劑中的吸收情況和吸收峰不相同。在三氯甲烷和石油醚中的番茄紅素在400～600 nm有3個明顯的吸收峰，位置分別在450、475、510 nm左右。在甲苯中番茄紅素在450～515 nm吸收較強(qiáng)；在丙酮中，番茄紅素在420～475 nm吸收較強(qiáng)，吸收峰在450 nm處；在正己烷中，番茄紅素在440 nm處有吸收峰，在430～495 nm吸收較強(qiáng)。β-胡蘿卜素在5種不同溶劑中吸收情況和吸收峰類似。溶解于5種不同溶劑中的β-胡蘿卜素在420～485 nm吸收較強(qiáng)，且吸收峰有1～2個，其中在440～465 nm均有1個吸收峰，而在甲苯中430 nm處還有1個吸收峰。

從β-胡蘿卜素對番茄紅素的檢測干擾程度來看，甲苯作為溶劑時番茄紅素吸收較強(qiáng)(450～500 nm)，此時β-胡蘿卜素的吸收也較強(qiáng)，對檢測干擾較大；三氯甲烷作為溶劑時在番茄紅素最大吸收峰472 nm處β-胡蘿卜素的吸收值高于番茄紅素，對檢測有較大干擾；正己烷作為溶劑時番茄紅素在472 nm處有較強(qiáng)吸收，而β-胡蘿卜素的吸收較低。丙酮和石油醚都有一定毒性，因此選擇正己烷作為檢測溶劑，并根據(jù)番茄紅素在正己烷中的吸收圖譜，選擇472 nm為測定波長。

目前文獻(xiàn)報道的番茄紅素的檢測方法主要有紫外分光光度法[19]、高效液相色譜法[20]、薄層色譜法[17]。液相色譜法存在程序復(fù)雜、檢測時間長，薄層色譜法存在耗時長、不易定量等問題。然而酶標(biāo)儀的測定仍然是基于紫外分光光度法，根據(jù)文獻(xiàn)[19]報道，由于β-胡蘿卜素分子和番茄紅素分子結(jié)構(gòu)均為長鏈多雙鍵的脂肪烴，檢測時β-胡蘿卜素對番茄紅素的干擾始終無法避免，但對于快速高通量檢測番茄紅素的產(chǎn)量是一種較為有效的手段。

a-甲苯;b-三氯甲烷;c-丙酮;d-正己烷;e-石油醚圖3 番茄紅素和β-胡蘿卜素在不同溶劑中的吸收圖譜Fig.3 Absorption spectrum of lycopene and beta-carotene in different solvent

2.3 番茄紅素在正己烷中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和檢測范圍的確定

在472 nm處測定一系列不同濃度的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液，以吸光值對番茄紅素的質(zhì)量濃度作圖，得到不同濃度的番茄紅素在正己烷中的吸收值(圖4-a)。由圖4-b 可知，番茄紅素在低質(zhì)量濃度0.05～12 mg/L時，吸光值和番茄紅素的質(zhì)量濃度成線性關(guān)系；質(zhì)量濃度高于20 mg/L時，吸光值隨番茄紅素質(zhì)量濃度的升高而增大，但沒有良好的線性關(guān)系。以正己烷為溶劑測得的回歸方程Y=0.070 3X+0.008 2(R2=0.997 2)。質(zhì)量濃度在0.5～12 mg/L，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度高，可用來計(jì)算番茄紅素產(chǎn)量。由圖4-c可知，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為0.01～0.5 mg/L時，吸收值沒有良好的線性關(guān)系，因此最低檢出限為0.5 mg/L。

a-0.01～50 mg/L番茄紅素在正己烷中的吸收;b-番茄紅素在正己烷中的標(biāo)準(zhǔn)曲線;c-低質(zhì)量濃度番茄紅素在正己烷中的吸收圖4 不同質(zhì)量濃度的番茄紅素在正己烷中的吸收Fig.4 Absorbance of lycopene with different concentrations in hexane

2.4 番茄紅素?fù)u瓶發(fā)酵測定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證初篩的9株重組菌顏色鑒別結(jié)果，選擇YPD基本培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵72 h后破碎細(xì)胞，最終產(chǎn)量用酶標(biāo)儀檢測。由于搖瓶發(fā)酵規(guī)模和重組菌產(chǎn)量較低的限制，為了篩選生產(chǎn)性能最優(yōu)的重組菌，僅在發(fā)酵結(jié)束時測定最終產(chǎn)量。從圖5可知，最高產(chǎn)量的重組菌TmE-PaB-BtI最終產(chǎn)量為1.33 mg/g DCW，表明來源于曼地亞紅豆杉的TmCrtE、成團(tuán)泛菌的PaCrtB和三孢布拉霉氏菌的BtCrtI組合，可強(qiáng)化番茄紅素生產(chǎn)能力。對比僅轉(zhuǎn)入pY26-PaCrtB-BtCrtI質(zhì)粒的對照菌499-PaB-BtI，當(dāng)整合3個拷貝數(shù)的AtCrtE后，AtE-PaB-BtI發(fā)酵72 h時產(chǎn)量為0.22 mg/g DCW，提高了2倍；當(dāng)整合3個拷貝數(shù)的PaCrtE后，PaE-PaB-BtI最終產(chǎn)量為0.35 mg/g DCW，提高了3.6倍；當(dāng)整合3個拷貝數(shù)的TmCrtE后，TmE-PaB-BtI最終產(chǎn)量提高了16.5倍。結(jié)果表明當(dāng)整合3個拷貝數(shù)的CrtE，提高了宿主菌中GGPP的積累，對番茄紅素產(chǎn)物的積累有利，而且曼地亞紅豆杉來源的TmCrtE比其他來源的CrtE對增加產(chǎn)物的積累更加有效。

由圖6可知，工程菌的生長速度比宿主菌YPH499△gal80慢，最終生物量均有所降低。10株工程菌中，PaE-PaB-BtI生長速度最為緩慢，最終生物量降僅為宿主菌的21.5%(圖6-b)；PaE-XdB-BtI和TmE-PaB-XdI這2株菌生長相對較好，但最終生物量僅為宿主菌的43.9%和45.3%(圖6-b、圖6-c)；與僅轉(zhuǎn)入pY26-PaCrtB-BtCrtI質(zhì)粒的對照菌499-PaB-BtI相比，整合表達(dá)3個拷貝數(shù)CrtE后對生長有一定影響，最終生物量降低33.2%～48.6%(圖6-d)。

圖5 釀酒酵母重組菌番茄紅素產(chǎn)量Fig.5 Lycopene production of recombinant S.cerevisiae strains

a-AtE-PaB-BtI生長曲線;b- PaE-PaB-BtI、PaE-McB-BtI、PaE-XdB-BtI、PaE-XdB-XdI生長曲線;c- TmE-PaB-BtI、TmE-PaB-XdI、TmE-XdB-BtI、TmE-XdB-XdI生長曲線;d- 499-PaB-BtI、AtE-PaB-BtI、PaE-PaB-BtI、TmE-PaB-BtI生長曲線圖6 釀酒酵母重組菌生長曲線Fig.6 Growth curve of recombinant S.cerevisiae strains

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC驗(yàn)證

對篩選最佳組合TmE-PaB-BtI的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品在相同時間范圍內(nèi)有多個出峰。

3 討論

隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，研究人員針對宿主細(xì)胞和目的產(chǎn)物生物合成途徑進(jìn)行目的性改造，在生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值的化合物(萜類、黃酮類等)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。目前已有很多文獻(xiàn)報道了構(gòu)建高效細(xì)胞工廠合成番茄紅素的策略。KIM等[21]引入成團(tuán)泛菌來源的CrtE、CrtB、和CrtI，過表達(dá)dxs和idi提高M(jìn)EP通量，并引入異源強(qiáng)化的MVA途徑從而強(qiáng)化IPP和DMAPP供給，最終產(chǎn)量達(dá)到1.35 g/L。陳艷[22]敲除GAL誘導(dǎo)系統(tǒng)，并敲除遠(yuǎn)端遺傳位點(diǎn)ypl062w后通過對番茄紅素合成路徑中異源基因來源(CrtE、CrtB、和CrtI)的組合篩選，獲得強(qiáng)化番茄紅素生產(chǎn)能力的較優(yōu)組合，利用啟動子強(qiáng)度和整合拷貝數(shù)對關(guān)鍵限速酶BtCrtI進(jìn)行微調(diào)，將番茄紅素產(chǎn)量提高到40.64 mg/g DCW。

a-500 mg/L番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品；b-TmE-PaB-BtI發(fā)酵產(chǎn)物圖7 番茄紅素和發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析Fig.7 HPLC analysis of lycopene and fermentation product

GGPP是釀酒酵母中番茄紅素合成途徑的關(guān)鍵前體物質(zhì)[23]，提高其供給能提高番茄紅素合成的通量。代謝工程中利用多基因重組技術(shù)對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行定向改造，構(gòu)建高效的合成途徑生產(chǎn)番茄紅素。不同物種來源的基因所編碼的酶的催化性能往往具有顯著差異，因此篩選不同物種來源的途徑基因(CrtE、CrtB、和CrtI)進(jìn)行組合優(yōu)化是提高合成途徑通量的有效手段。

文獻(xiàn)報道曼地亞紅豆杉來源的TmCrtE比其他來源的CrtE的底物(FPP)結(jié)合口袋更大，對FPP的親和性更高[16]，因此轉(zhuǎn)入表達(dá)質(zhì)粒后顏色較深。木鱉果來源McCrtB和三孢布拉霉氏菌來源BtCrtI組合后菌體呈淺黃色，而成團(tuán)泛菌來源PaCrtB和BtCrtI組合后菌體呈黃色但較前者深，因此木鱉果來源McCrtB在釀酒酵母中表達(dá)并不是一個好的選擇。作為蝦青素生產(chǎn)菌的紅法夫酵母能合成番茄紅素，而文獻(xiàn)已闡明CrtYB是一個雙功能酶，包括八氫番茄紅素合酶功能域和β-胡蘿卜素環(huán)化酶功能域2個部分，因此當(dāng)異源表達(dá)XdCrtB時，菌體合成的一部分番茄紅素會被異構(gòu)成β-胡蘿卜素，最終產(chǎn)物不純，因此最終篩選得到1株最優(yōu)組合的菌株，即TmCrtE、PaCrtB、BtCrtI，搖瓶發(fā)酵最終產(chǎn)量為1.33 mg/g DCW，為進(jìn)一步獲得高產(chǎn)番茄紅素細(xì)胞工廠提供基礎(chǔ)。然而本研究發(fā)酵篩選時僅僅測定發(fā)酵結(jié)束時的產(chǎn)量，由于搖瓶發(fā)酵規(guī)模的限制和重組菌產(chǎn)量較低的問題，過程中間產(chǎn)量并未測定。同時為了快速高通量檢測番茄紅素的含量，本研究優(yōu)化了傳統(tǒng)的分光光度法，用丙酮振蕩提取細(xì)胞破碎混合物，再用正己烷溶解番茄紅素并用酶標(biāo)儀檢測。這種檢測方法始終基于紫外分光光度法，產(chǎn)物中β-胡蘿卜素對番茄紅素的干擾始終是消除的，為快速檢測和高通量檢測提供了思路。