產γ-內酰胺酶菌株的篩選及鑒定

孫康，李盼盼，于爽，遲乃玉*

1(大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連，116622)2(遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連，116622)

2-氮雜二環-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮是一種雙環酰胺類化合物，俗稱γ-內酰胺、文斯內酯。它是制藥工業的一種重要醫藥中間體，可以合成包括治療艾滋病的阿巴卡韋及治療甲型流感的帕拉米韋在內的諸多藥物[1]。作為多種藥物的合成原料，γ-內酰胺自身卻是未經拆分的外消旋體化合物，包含(-)γ-內酰胺及(+)γ-內酰胺兩種構型。從源頭上拆分(±)γ-內酰胺，能為合成單一構型藥物奠定堅實基礎，實現更安全和更有效的臨床給藥[2]。

目前，制備單構型γ-內酰胺的方法有不對稱合成法、循環優先結晶法和生物不對稱拆分法[3-5]。前2種方法存在產率低純度不高等缺陷，生物不對稱拆分法是利用環境中篩選到的特定菌株，選擇性降解某一構型的γ-內酰胺，從而達到拆分(±)γ-內酰胺的目的。生物法具有反應條件溫和、效率高、環境友好、利于工業放大等優點[5-6]。TAYLOR等[7]最早利用產γ-內酰胺酶的菌株實現了(±)γ-內酰胺的拆分，并利用(-)γ-內酰胺合成了(-)阿巴卡韋。國內鄭國鈞團隊最早開展這方面研究，相繼發現了硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)、氧化烴微桿菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)、磚紅色微桿菌(Microbacteriumtestaceum)等產γ-內酰胺酶菌株[8-13]。目前存在的普遍問題是菌株立體選擇性差，已報道菌株中相當一部分既產(+)γ-內酰胺酶又產(-)γ-內酰胺酶，制約了其在工業生產中的應用[14-15]。

本研究利用平板篩選法結合液相色譜法，從渤海海泥樣品中篩選出2株具有高立體選擇性的產γ-內酰胺酶菌株，采用形態觀察及分子生物學技術對其進行鑒定，并進行了生產小試研究，為2種構型γ-內酰胺的制備提供了優質的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑

海泥，采集于遼寧省大連渤海灣；異丙醇、乙腈、正丁醇(均為色譜級)，天津科密歐化學試劑有限公司；N-乙酰-L-苯丙氨酸(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-氮雜雙環[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司；剩余其他試劑，均為國產分析純。

1.1.2 培養基

篩選培養基[16](g/L)：N-乙酰-L-苯丙氨酸2，酵母浸粉0.1，NH4Cl 2，NaH2PO40.1，Na2HPO40.1，MgSO40.1，瓊脂粉20，pH 7.0。

種子培養基[17](g/L)：酵母浸粉5，葡萄糖5，KH2PO47，MgSO40.4，FeSO40.02，CaCl20.02，NH4Cl 5，pH 7.0。

發酵培養基：同種子培養基。

以上培養基均在121 ℃高溫滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設備

SHIMADZU-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；250 mm×4.6 mmAS-H手性色譜柱，日本大賽璐公司；LA2-4A1生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；LTI-700恒溫培養箱，上海愛郎儀器有限公司；2WY-2102C恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；CR21N大容量冷凍離心機，日本日立公司；D-37520小容量離心機，美國賽默飛世爾科技公司；pHS-3EpH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；YXQ-LS-100Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有效公司；5 L發酵罐，上海百侖生物科技有限公司；RV8旋轉蒸發儀，德國艾卡公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 產γ-內酰胺酶菌株的初篩

自然界中存在一些微生物能夠利用N-?；衔镒鳛樗鼈兾ㄒ坏奶荚矗鼈冎邢喈斠徊糠之aγ-內酰胺酶[18]。篩選培養基以N-乙酰-L-苯丙氨酸作為主要碳源，微生物能在其上生長即證明菌體有水解酰胺鍵的能力，是γ-內酰胺酶的潛在來源菌株。大連渤海灣海泥樣品共5份，每次取1.0 g左右海泥土樣加入到5 mL無菌蒸餾水中，充分混勻，隨后進行梯度稀釋，取200 μL梯度稀釋液涂布于篩選培養基平板，28 ℃條件下培養2～5 d，菌株陸續長出，挑取單菌落使用平板劃線法進一步純化。

1.2.2 產γ-內酰胺酶菌株的復篩

將初篩得到的菌株接種于液體篩選培養基，28 ℃、150 r/min條件下培養2～5 d。按5%(體積比)的接種量將菌液接種于種子培養基，菌株在種子培養基中生長較快，28 ℃、150 r/min條件下培養1 d即可。取100 mL菌液8 000 r/min離心10 min，棄上清液，離心沉淀表面用0.05 mol/L、pH 7.0的磷酸鈉緩沖液清洗，加入10 mL上述磷酸鈉緩沖液重懸菌體。設立1 h反應組和24 h反應組，分別取2 mL重懸菌液，加入0.5 mL含質量濃度為50 g/L (±)γ-內酰胺的磷酸鈉緩沖液，置于28 ℃、 150 r/min搖床中反應1、 24 h。反應完成后取1.5 mL反應液8 000 r/min離心5 min，取0.75 mL上清液，加入0.75 mL正丁醇，反復混勻靜置實現萃取。將反應液-正丁醇混合液10 000 r/min離心5 min，吸取上層液體過0.45 μm針頭式濾膜。

采用高效液相色譜檢測(±)γ-內酰胺[19]，高效液相色譜條件為AS-H手性色譜柱，流動相為V(乙腈)∶V(異丙醇)=9∶1，流速0.6 mL/min，上樣量10 μL，檢測波長230 nm。

1.2.3 產γ-內酰胺酶菌株的鑒定

形態觀察：將試驗菌株劃線于固體LB(Luria-Bertani)平板上，28 ℃恒溫培養1～2 d，觀察菌株的菌落形態特征，并挑取單菌落，進行革蘭氏染色，觀察細菌的細胞形態。

分子生物學鑒定：挑取單菌落于5 mL種子培養基，28 ℃、200 r/min恒溫過夜培養，采用細菌基因組提取試劑盒提取基因組，以其為模板，利用引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增[20]，將PCR擴增產物送至上海生工股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)的GenBank數據庫中，與已知菌種的16S rDNA序列進行BLAST比對，選取若干條同源性較高的菌株的16S rDNA序列，采用MEGA-X軟件中的鄰接算法(neighbor joining，NJ)構建系統發育樹。

1.2.4 產γ-內酰胺酶菌株的小試生產

種子液的制備：將菌株接種于200 mL液體種子培養基，28 ℃、150 r/min條件下培養1 d。

發酵罐培養及轉化：按1%(體積比)接種量將種子液接種于含有發酵培養基的發酵罐中，裝液量為4 L/5 L，于25 ℃、200 r/min條件下培養20 h。將培養液8 000 r/min離心10 min，采用0.05 mol/L、pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液洗滌沉淀，將沉淀加入到裝有1 L 50 g/L (±)γ-內酰胺磷酸鈉緩沖液的發酵罐中，于25 ℃、200 r/min條件下反應24 h。其間每隔數小時取樣檢測，計算產物的對映體過量值(enantiomeric excess，ee值)，該數值能直觀反映手性化合物的光學純度，ee值越高，光學純度也越高[21]，對映體過量值計算如公式(1)所示：

(1)

式中：C-為液相分析中(-)γ-內酰胺的峰面積；C+為液相分析中(+)γ-內酰胺的峰面積。

產物回收：當ee值達到99.0%及以上時，將反應液8 000 r/min離心10 min，上清用500 mL乙酸乙酯萃取，利用旋轉蒸發儀回收干燥，即得到終產物。

2 結果與分析

2.1 產γ-內酰胺酶菌株的篩選

2.1.1 菌株的初篩

利用篩選培養基從海泥樣品中篩選得到24株菌，它們能夠在篩選培養基上生長即證明了它們具有水解酰胺鍵的能力，是γ-內酰胺酶的潛在來源菌株，它們中部分在篩選培養基上培養的菌落形態如圖1所示。

圖1 部分初篩菌株的菌落形態圖Fig.1 Colony morphology of some primary screened strains

2.1.2 菌株的復篩

復篩過程中發現，放線菌、霉菌不適合液體培養及離心以致于無法繼續復篩實驗，所以復篩檢驗的主要是初篩結果中的各類細菌。如表1所示，初篩得到的菌株近乎都具有降解(±)γ-內酰胺的能力，其中菌株LP7與LY9的立體選擇性較好，菌株LP7只降解(+)γ-內酰胺，菌株LY9只降解(-)γ-內酰胺。

表1 復篩菌株降解(±)γ-內酰胺情況Table 1 Degradation of (±)γ-lactam by rescreened strains

菌株LP7及LY9降解(±)γ-內酰胺的結果如圖2所示。由圖2可知，反應1 h內，菌株LP7選擇性降解了(+)γ-內酰胺，菌株LY9選擇性降解了(-)γ-內酰胺。且反應24 h組與反應1 h組結果相當，未有另一構型的γ-內酰胺被降解的跡象，所以菌株LP7和菌株LY9都不產另一種構型的γ -內酰胺酶，立體選擇較好。經多次傳代，菌株LP7及LY9依舊具有較好的立體選擇性，菌株穩定性良好。

值得注意的是，氧化烴微桿菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)[22-23]、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)[24-25]、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)[17]等并不是一開始就發現菌體內包含(±)2種γ-內酰胺酶，而是在進一步研究過程中發現的，究其原因還是實驗方法中菌體參與量過小、反應時間不夠長，以致另一種酶的作用被掩蓋忽略。本研究在復篩方法中加大了菌體參與反應的量，并在1 h和24 h兩個時間節點檢測底物降解情況，因而很容易觀察到第2種酶的存在，避免了上述情況的發生。

2.2 產γ-內酰胺酶菌株的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株LP7和菌株LY9菌落形態如圖3所示。由圖3-a可知，菌株LP7在LB固體培養基上菌落呈淡粉紅色、圓形、表面光滑。由圖3-b可知，菌株LY9在LB固體培養基上菌落呈米黃色、圓形、表面光滑。

a-菌株LP7;b-菌株LY9;c-對照組圖2 反應1 h組菌株LP7及LY9底物降解液的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography of substrate degradation solution of strain LP7 and LY9 in 1 h group

a-菌株LP7的平板培養;b-菌株LY9的平板培養圖3 菌株LP7和LY9的菌落形態Fig.3 Colonial morphology of strain LP7 and LY9

2.2.2 分子生物學鑒定

將菌株LP7及LY9的16S rDNA序列在GenBank數據庫中進行同源性比對，結果表明，菌株LP7與Arthrobacter屬的多個菌種的序列相似性>97%，菌株LY9與Psychrobacter屬的多個菌種序列相似性>97%。采用MEGA-X軟件中的NJ算法構建系統發育樹，結果如圖4所示。由圖4可知，菌株LP7與運動節桿菌(Arthrobacteragilis)聚于一支，親緣關系最近，且菌株LP7與運動節桿菌菌落呈粉紅色的性狀一致，因此鑒定菌株LP7為運動節桿菌(Arthrobacteragilis)。菌株LY9與糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)聚于一支，親緣關系最近，且菌株LY9與糞嗜冷桿菌菌落呈米黃色的性狀一致，因此鑒定菌株LY9為糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)。

圖4 基于16S rDNA序列菌株LP7及菌株LY9的系統發生樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain LP7 and strain LY9 based on 16S rDNA sequence

2.3 產γ-內酰胺酶菌株的小試生產

相較菌種篩選，小試生產擴大了反應體系、降低了菌株參與反應的比例、加大了底物質量濃度，因而降解所需時間有所延長，但更為經濟實用。利用菌株LP7和LY9降解(±)γ-內酰胺的產物ee值變化曲線如圖5所示。由圖5-a可知，利用LP7降解的產物第35 h ee值達到99.4%，(+)γ-內酰胺基本降解完畢。由圖5-b可知，利用LY9降解的產物第10 h ee值達到99.5%，(-)γ-內酰胺基本降解完畢。菌株LY9降解(-)γ-內酰胺的效率要快于菌株LP7降解(+)γ-內酰胺，后經過產物回收，分別得到了光學純度達99.0%以上的(+)γ-內酰胺、(-)γ-內酰胺。

a-菌株LP7;b-菌株LY9圖5 菌株LP7、菌株LY9降解(±)γ-內酰胺產物ee值變化圖Fig.5 Changes in ee values of (±)γ-lactam products degraded by strain LP7 and strain LY9

3 結論

本研究利用平板篩選法及液相色譜法，從渤海海泥中篩選得到2株具有高立體選擇性的產γ-內酰胺酶菌株。菌株LP7產(+)γ-內酰胺酶，通過16S rDNA測序分析結合形態學觀察，鑒定為運動節桿菌(Arthrobacteragilis)；菌株LY9產(-)γ-內酰胺酶，通過16S rDNA測序分析結合形態學觀察，鑒定為糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)。經小試生產驗證，2株菌可分別用來制備高光學純度的(-)γ-內酰胺、(+)γ-內酰胺，因而具備有開發應用價值，為進一步合成單構型藥物奠定了堅實基礎。