微凍保鮮對紅鰭東方鲀貯藏品質的影響

劉欣榮，申亮，齊鳳生，劉紅英*

1(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定，071000)2(河北農業大學 海洋學院，河北 秦皇島，066000)

東方鲀屬是典型可食用鲀類代表，其中紅鰭東方鲀個體大，成長所需時間短，是營養價值很高的經濟魚類[1]。養殖紅鰭東方鲀毒素含量低，味道鮮美，營養價值高，脂肪含量低，蛋白質、不飽和脂肪酸、氨基酸等物質含量豐富[2-3]，維生素B1、B2、硒、鋅等多種微量元素含量較高[4]。市場上紅鰭東方鲀主要以活魚和處理后無毒的低溫保鮮魚肉進行銷售。隨著社會經濟的發展，人們對紅鰭東方鲀貯藏過程中的營養價值及感官品質的要求越來越嚴苛。魚肉在貯藏過程中會出現質構軟化、口感變軟和刺鼻氣味加重等品質劣變現象[5]，導致營養價值和消費者滿意度下降。可食用鲀類的貯藏保鮮問題已成為行業和學者共同關注的話題。

微凍保鮮技術是一種輕度冷凍或者部分冷凍的保鮮技術[6-7]，是保鮮領域一項新技術[8-9]，微凍保鮮下細胞內形成的冰晶較小，對于細胞結構的破壞程度小[10]，可最大程度保持水產品細胞的完整度，保存水產品原有的營養物質，而且可以抑制細菌繁殖，解凍時汁液流失率較低，解凍后水產品表觀顏色佳，無干耗，耗能較低[11-12]。微凍貯藏過程中溫度波動會產生重結晶，會加劇水產品的劣變，因此微凍保鮮對溫度控制技術的要求很嚴苛，使得該技術尚未在市場普遍應用。季曉彤[13]研究了微凍過程中金鯧魚的品質變化，結果表明魚肉硬度、咀嚼性、肌漿、肌原纖維中巰基含量均呈下降趨勢，貯藏期間內源性蛋白酶一直具有生物活性。LILIAN等[14]研究了微凍過程中真空包裝三文魚的微觀結構，發現貯藏過程中冰晶分布存在顯著差異。

據調查，國內外對于紅鰭東方鲀保鮮方面的研究甚少，且紅鰭東方鲀魚肉中蛋白質和水分含量較高，較其他魚類而言更容易發生腐敗變質，不利于貯藏過程中的品質保持。相對于低溫凍藏而言，微凍貯藏對細胞造成的損傷較小，更有利于水產品營養的保留，因此對于紅鰭東方鲀微凍過程中品質變化的研究格外重要。本文以紅鰭東方鲀為研究對象，通過分析微凍過程中魚肉理化指標、質構及微觀組織結構的變化，研究了微凍對紅鰭東方鲀魚肉品質的影響，以期為紅鰭東方鲀保鮮技術的研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅鰭東方鲀,購于秦皇島市場，個體鮮活，組織良好，體長約19 cm，質量約500 g；硼酸，天津市科密歐化學試劑有限公司；HCl，天津市凱通化學試劑有限公司；K2CO3、溴甲酚綠、NaCl、95%乙醇，天津歐博凱化工有限公司；凡士林、甲醛，天津市風船化學試劑科技有限公司；甲基紅，天津市北辰方正試劑廠；2-硫代巴比妥酸，國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸，福晨(天津)化學試劑有限公司；平板計數瓊脂，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；冰醋酸，廣州市信洪貿易有限公司；苦味酸，北京盈澤通匯生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

電子天平，上海光正醫療儀器有限公司；FA2004分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；721型可見分光光度計、HH-6數顯恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司；MJ-BL25B3攪拌機，廣東美的生活電器制造有限公司；F6/10手持式高速勻漿機，上海凈信實業發展有限公司；3K30臺式高速冷凍離心機，德國SIGMA實驗室離心機公司；PHS-3CpH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；BC/BD-320HK海爾冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司；XFH-30CA電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫療器械有限公司；BX51奧林巴斯顯微鏡，上海通灝光電科技有限公司；徠卡R2235切片機，德國；SW-CJ-2F無菌操作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；美國FTC-質構儀TMS-PRO，美國。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅鰭東方鲀預處理

鮮活紅鰭東方鲀除去內臟、魚皮、魚骨，切成 4 cm×2 cm×2 cm大小的魚塊，用無菌蒸餾水洗凈，吸水紙吸干表面水分，然后將魚肉分裝到無菌自封袋中，每袋300 g左右，置于-3 ℃冰柜中進行微凍保鮮，每隔5 d進行取樣測定。

1.2.2 冰點的測定[15]

取5 cm×3 cm×2 cm的紅鰭東方鲀魚肉置于溫度為-25 ℃的冰柜中，將溫度計插頭插入魚塊中心，每隔2 min測1次魚肉中央的溫度，以凍結時間為橫坐標、中心溫度為縱坐標繪制紅鰭東方鲀魚肉凍結曲線，根據凍結曲線的拐點得出紅鰭東方鲀魚肉的冰點。

1.2.3 菌落總數的測定[16]

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品衛生物學檢驗 菌落總數測定》的平板培養計數法檢測魚肉微生物的總數。實驗平行3次。

1.2.4 pH值的測定[17]

準確稱5.00 g絞碎的魚肉于燒杯中，加入50 mL蒸餾水，混勻后浸提30 min，pH計測量上清液pH值。實驗重復3次。

1.2.5 水分含量的測定[18]

準確稱3.00 g絞肉機絞碎的魚肉于稱量皿中，(105±1) ℃烘箱干燥恒重3 h。測定重復3次。記錄干燥恒重前后稱量瓶和魚肉的總質量分別為W1和W2，水分含量計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.6 持水力的測定[19]

準確稱5.00 g魚肉于帶濾紙的離心管中，稱離心管和魚肉的總質量記作W1，-2 ℃下5 000 r/min離心30 min，然后取出濾紙，除去魚肉表層和管內壁的汁液，稱離心管和魚肉的總質量記作W2。測定重復3次。持水力計算如公式(2)所示：

(2)

式中：W是1.2.5中得出的水分含量。

1.2.7 汁液流失率的測定[20]

取出貯藏的魚肉，準確稱10.00 g魚肉于燒杯中，25 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，用濾紙除去燒杯外的水，稱燒杯、魚肉、滲出汁液的總質量記作W1，以及燒杯質量W3，除去燒杯內壁和魚肉表層的汁液，記燒杯和魚肉的總質量W2。實驗平行3次。汁液流失率按公式(3)計算：

(3)

1.2.8 揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)的測定[21]

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的微量擴散法測定TVB-N的值。每個樣品做3次平行。

1.2.9 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)的測定

參照徐貞[22]的測定方法，略有改動。

(1)樣品預處理

準確稱取5.00 g絞碎的魚肉于燒杯中，先后加25 mL三氯乙酸溶液(質量分數為20%)和20 mL蒸餾水，均質后浸提1 h。

(2)測定方法

將浸提后的溶液過濾至50 mL容量瓶中，蒸餾水定容。取5 mL濾液于試管中，加5 mL硫代巴比妥酸溶液(濃度為0.02 mol/L)，振蕩混勻，沸水浴(99 ℃)20 min，然后用自來水降至室溫，用分光光度計測定532 nm處吸光度(A)。測定重復3次。TBA計算如公式(4)所示：

TBA/[mg·(100g)-1]=7.8×A

(4)

1.2.10 質構的測定[23]

取2 cm×2 cm×1 cm紅鰭東方鲀背部肌肉，采用質構儀全質構模式對其硬度、彈性、咀嚼性、回復性進行測定。實驗參數：壓縮變形60%，觸發力5 g，測前速度3 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，二次壓縮間隔時間5 s。測定重復3次。

1.2.11 微觀組織結構的測定[24]

切取2 cm×2 cm×1 cm大小的紅鰭東方鲀背部肌肉，將肌肉置于配制好的甲醛固定液中進行固定，固定48 h，然后在流水下沖洗12 h，將肌肉切成4 mm×3 mm×2 mm大小，用不同濃度梯度的乙醇溶液進行脫水，用二甲苯透明，然后將肌肉浸蠟包埋切片，將切片浸入Bouin氏液中，把切片和Bouin氏液一同置于37 ℃恒溫箱2 h，在流水下沖洗至沒有黃色，切片分別通過天青石藍染色液、Mayer蘇木素染色液、酸性乙醇分化液、麗春紅品紅染色液、苯胺藍染色液進行染色，弱酸處理2 min，95 %(體積分數)乙醇溶液脫水，二甲苯透明3次，中性樹膠封蓋，然后蓋上蓋玻片，用10倍顯微鏡進行觀察。

1.3 數據分析

試驗數據采用Excel 2010進行統計，并繪制試驗數據曲線，試驗結果采用平均數表示，采用SPSS 17.0進行顯著性分析，經雙變量分析方法進行兩兩比較，采用雙尾檢驗，P<0.05時顯著相關。

2 結果與分析

2.1 紅鰭東方鲀凍結曲線

圖1為紅鰭東方鲀的凍結曲線。由圖1可以看出，紅鰭東方鲀魚肉中心溫度由初始19.3 ℃開始下降，在24 min時降到0.4 ℃，魚肉中心溫度在前24 min下降迅速，冷凍至32 min以后進入一段平穩期，在這個溫度范圍內，水產品中大部分水分結成冰，放出相應的潛熱，整個凍結過程中大部分熱量是在這一階段放出，所以溫度變化速度慢，曲線平坦。平穩期魚肉中心溫度為-0.9 ℃，冷凍至62 min時結束平穩期，這段平穩期為魚肉最大冰晶生成帶，平穩期后魚肉中心溫度下降趨勢增大，142 min時魚肉中心溫度降到-25 ℃，溫度進入平穩階段不再下降。冰點是指水和冰平衡共存時的溫度，此時由于水和冰之間的相變熱使魚肉的溫度維持平穩的狀態，因此將-0.9 ℃定為紅鰭東方鲀的冰點。微凍保鮮是將魚肉置于略低于其冰點1～2 ℃的溫度下進行保鮮的方法[25]。由于試驗測定紅鰭東方鲀的冰點為-0.9 ℃，故將微凍保鮮溫度定為-3 ℃。

圖1 紅鰭東方鲀凍結曲線Fig.1 Freezing curve of Takifugu rubripes

2.2 菌落總數的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉菌落總數的變化如圖2所示，新鮮紅鰭東方鲀的菌落總數為2.97 lg CFU/g，微凍過程中菌落總數呈上升趨勢，上升速率逐漸增大。這是由于微凍可以抑制微生物體內的酶活性，使微生物幾乎不能繁殖，同時，微凍期間微生物體內部分水結冰，使水分活度降低，細胞液濃度升高[26]，理化反應發生改變。貯藏過程中魚肉中的有機物被微生物和酶分解為小分子營養物質，促進微生物生長繁殖，故微生物數量增加速率隨著貯藏時間的延長逐漸增加。貯藏第10天菌落總數為4.58 lg CFU/g，至第15天時菌落總數增加到6.54 lg CFU/g，超過了國家標準規定的水產品可食用閾值5.0 lg CFU/g[27]。

圖2 紅鰭東方鲀微凍過程中菌落總數的變化Fig.2 Change of total plate counts during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.3 pH值的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉pH的變化如圖3所示，紅鰭東方鲀pH值先下降后上升，在貯藏第10天時pH達到最低值，最低點之前pH值下降速率較快，pH值從第10天開始上升，上升速率緩慢，貯藏第25天時pH為6.21。這是由于微凍貯藏降低了魚肉酶和微生物對蛋白質的分解作用，使氨等堿性物質生成量減少，故上升速率較慢。較冷藏而言，微凍保鮮可有效抑制紅鰭東方鲀的自溶作用，產生的堿性物質減少，磷酸化水平較低[28-29]，從而使魚肉的保鮮期延長。

圖3 紅鰭東方鲀微凍過程中pH的變化Fig.3 Change of pH during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.4 持水力的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉持水力的變化如圖4所示，魚肉持水力隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢，貯藏前15 d持水力下降速率較小，第15～25天持水力下降速率增大，貯藏至第25天下降到68.62 g/100g。由于微凍使魚肉中的水分結冰，貯藏過程中細胞內冰晶數量逐漸增多，部分冰晶體積增大，對細胞結構的破壞程度逐漸增大，且微凍抑制了內源酶和外源微生物的分解作用，前期微生物和酶數量少，組織細胞較完整，離心時細胞內的組織液外滲較少；貯藏后期微生物繁殖使得分解作用增大，部分微生物代謝產物含有酶，與魚肉內源酶共同作用，使分解速率加快，細胞內、細胞間水分和組織液增多，且細胞被破壞程度逐漸增大，故魚肉離心損失量逐漸增大。魚肉的持水力越大，說明魚肉組織蛋白被破壞的程度越小，魚肉品質越好。

圖4 紅鰭東方鲀微凍過程中持水力的變化Fig.4 Change of water holding capacity during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.5 汁液流失率的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉汁液流失率的變化如圖5所示，貯藏過程中汁液流失率呈上升趨勢。貯藏前5 d上升速率較大，第5～25天上升速率較小，呈逐漸增大的趨勢，貯藏至第25 d上升到16.93 g/100g。這是由于微凍過程中魚肉pH的變化，一方面使蛋白質對水分子的束縛力減弱，另一方面使蛋白質分子的正負基團相互吸引靠近，使分子內水分被擠出[30]。魚肉中酶和微生物的分解作用，使細胞結構被破壞，以上原因均使魚肉汁液流失率增大。微凍后期由于冰晶數量和體積的增大、蛋白質結構的變化導致汁液流失率增大[26]。微凍過程中細胞中的水分變成冰晶，使細胞結構被破壞，解凍后融化的冰晶不會被細胞完全吸收，便會形成汁液流失，而冰晶的形成改變了細胞的滲透壓，有抑菌的作用，可減少細胞液的流失[31]。汁液流失率增大，魚肉中營養物質流失的增多，魚肉品質變劣。

圖5 紅鰭東方鲀微凍過程中汁液流失率的變化Fig.5 Change of juice loss rate during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.6 TVB-N的變化

揮發性鹽基氮是度量魚類鮮度的重要指標，根據GB/T 18108—2019[32]可知，一級鮮度界限為≤15 mg/100g，二級鮮度界限為≤20 mg/100g，三級鮮度界限為≤30 mg/100g。微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉TVB-N的變化如圖6所示，微凍過程中紅鰭東方鲀的TVB-N呈上升趨勢。貯藏第10天時TVB-N為11.9 mg/100g，屬于一級品鮮度，貯藏第15天為15.87 mg/100g，屬于二級品鮮度，貯藏至第25天上升到21.7 mg/100g，屬于三級品鮮度，在可食用范圍內。貯藏過程中魚肉中含氮物質在酶和微生物的分解作用下，生成氨氮類揮發性物質[33]。隨著菌落總數的增加，氨氮類物質含量增加，曲線上升速率逐漸增大。

圖6 紅鰭東方鲀微凍過程中TVB-N的變化Fig.6 Change of TVB-N during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.7 TBA的變化

硫代巴比妥酸值是常用的判定水產品脂肪酸氧化程度的指標，其原理是脂肪酸氧化產生的丙二醛和硫代巴比妥酸反應生成粉紅色化合物。微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉TBA的變化如圖7所示，貯藏過程中TBA呈上升趨勢。貯藏前期是脂肪酸氧化酸敗誘導期[34]，貯藏前10 d增加速率平緩，至第10天開始TBA值增加速率明顯增加，增加速率隨貯藏時間的延長逐漸增大。貯藏第10天時TBA值為0.185 mg/100g，貯藏至第25天升到0.328 mg/100g。這是由于微凍過程中細胞結構被破壞，使不飽和脂肪酸與空氣接觸面積增加，氧化產生的丙二醛增加，與硫代巴比妥酸反應增加。故TBA值可代表魚肉中脂肪的氧化程度，TBA值越大，魚肉中脂質被氧化的程度越大，魚肉品質越差。

圖7 紅鰭東方鲀微凍過程中TBA的變化Fig.7 Change of TBA during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.8 質構的變化

質構是評價水產品優劣的重要因素。細胞結構隨凍融過程發生很大變化，冰晶使細胞中自由水含量降低，使組織細胞比表面積增大[35]，使組織細胞受損，細胞間隙增大，從而使肉質變軟且失去彈性。水產品的質構在一定程度上反映了食品的感官質量，通常可以通過硬度、彈性、咀嚼性等來表征。

2.8.1 硬度的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀背部肌肉硬度的變化如圖8所示，新鮮紅鰭東方鲀背部肌肉的硬度為0.233 N。微凍過程中硬度呈下降趨勢。其中微凍貯藏前15 d硬度下降速率較大，貯藏第15天硬度為0.113 N，貯藏第15～25天背部肌肉的硬度下降速率變緩慢，貯藏第25天下降至0.080 N。這是由于微凍過程中，微生物和酶的分解作用使得肌肉組織中蛋白質結構發生變化，魚肉中肌原組織、連接組織被破壞，從而使肌肉硬度下降。隨著魚肉硬度的下降，軟化程度增加，魚肉品質變差。軟化是魚肉加工及貯藏過程中需解決的關鍵性問題，減緩魚肉的軟化進程對于魚肉相關產業具有很高的經濟價值[36]。

圖8 紅鰭東方鲀微凍過程中硬度的變化Fig.8 Change of hardness during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.8.2 彈性的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀背部肌肉彈性的變化如圖9所示，紅鰭東方鲀背部肌肉的彈性隨著微凍貯藏時間的延長呈下降趨勢，與硬度顯著性正相關(P<0.01)。新鮮紅鰭東方鲀背部肌肉的彈性為0.98，微凍貯藏至25 d時彈性下降至0.56，其中微凍貯藏前5 d背部肌肉硬度下降速率較大。貯藏期間出現的上升點，可能是由于紅鰭東方鲀致死時間的差異，使得貯藏過程中蛋白質組成出現差異。

圖9 紅鰭東方鲀微凍過程中彈性的變化Fig.9 Change of springiness during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.8.3 咀嚼性的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀背部肌肉咀嚼性的變化如圖10所示，微凍過程中咀嚼性呈下降趨勢。微凍貯藏前20 d背部肌肉的咀嚼性下降趨勢緩慢，貯藏第20天咀嚼性為-0.159 N，貯藏第20～25天背部肌肉咀嚼性下降速率急劇增大，貯藏至第25天下降到-0.395 N。

圖10 紅鰭東方鲀微凍過程中咀嚼性的變化Fig.10 Change of chewiness during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.8.4 回復性的變化

微凍過程中紅鰭東方鲀背部肌肉回復性的變化如圖11所示，新鮮紅鰭東方鲀背部肌肉的回復性是0.721，微凍過程中回復性呈下降趨勢。貯藏過程中回復性下降速率隨著貯藏時間的延長而逐漸增大，微凍貯藏至第25天時紅鰭東方鲀背部肌肉的回復性降至0.383。

圖11 紅鰭東方鲀微凍過程中回復性的變化Fig.11 Change of resilience during micro-frozen of Takifugu rubripes

2.9 微觀組織結構的變化

2.9.1 橫向組織切片分析

微凍過程中紅鰭東方鲀背部肌肉組織橫向切片如圖12所示，新鮮紅鰭東方鲀背部肌肉組織細胞大小均勻，排列緊密，肌肉內膜光滑平緩，分布均勻，細胞內無空隙。貯藏至第10天，細胞內出現空隙。隨著貯藏時間的延長，肌肉組織細胞間的空隙逐漸變大，細胞內空隙增多。一方面，微凍過程中細胞內、細胞間生成冰晶，對細胞產生機械損傷，使細胞內水分流失，且冰晶使細胞液濃度上升，使部分結構蛋白質發生變性[37]，貯藏時間越久，蛋白質變性程度越大，細胞的機械損傷程度越大，細胞間空隙越大。另一方面，pH的下降導致了Ca2+的外泄[38]，使肌細胞無法收縮，從而造成細胞間空隙逐漸增大。

C0、C5～C25分別為新鮮紅鰭東方鲀微凍貯藏5、10、15、20、25 d肌肉組織橫向切片圖12 微凍過程中紅鰭東方鲀肌肉組織橫向切片Fig.12 Muscle tissue transverse section of Takifugu rubripes during micro-frozen

2.9.2 縱向組織切片分析

微凍過程中紅鰭東方鲀背部肌肉組織縱向切片如圖13所示，新鮮紅鰭東方鲀背部肌肉組織縱切面細胞排列緊密，微凍過程中紅鰭東方鲀魚肉的肌肉束間的間隙隨著貯藏時間的延長而逐漸增大，微凍貯藏初期肌肉束排列緊密且完整，隨著貯藏時間的延長，部分肌肉纖維束出現斷裂，且肌肉束間出現空隙。這是由于低溫使得組織細胞內和細胞間生成大小不同的冰晶，細胞內外壓力增大，對細胞造成機械損傷。貯藏后期肌原纖維、結構蛋白不斷被降解，使肌肉束之間空隙增大，肌肉束斷裂增多[39]。由此可知，肌肉束之間的間隙隨著貯藏時間的延長而越來越大，肌肉束斷裂隨著貯藏時間的延長而逐漸增多，說明微凍貯藏的時間對紅鰭東方鲀魚肉肌肉束的完整度影響很大。

D0、D5～D25分別為新鮮紅鰭東方鲀，微凍貯藏5、10、15、20、25 d肌肉組織縱向切片圖13 微凍過程中紅鰭東方鲀肌肉組織縱向切片Fig.13 Muscle tissue longitudinal section of Takifugu rubripes during micro-frozen

3 結論

本實驗以紅鰭東方鲀為研究對象，研究了微凍貯藏過程中紅鰭東方鲀魚肉品質的變化，主要結論如下，-3 ℃微凍貯藏過程中，紅鰭東方鲀pH值呈先下降后上升的趨勢，貯藏第10天時pH達到最低值6.10；汁液流失率、TVB-N、TBA、菌落總數呈上升趨勢，其中貯藏第15天時TVB-N、TBA分別為15.87 mg/100g、0.242 mg/100g，屬于二級品鮮度，貯藏至第15天時菌落總數增加到6.54 lg CFU/g，超過了水產品國家標準規定的可食用閾值5.0 lg CFU/g；持水力、硬度、彈性、咀嚼性、回復性呈下降趨勢；由紅鰭東方鲀背部肌肉橫向和縱向切片顯微結構觀察結果得出，隨著貯藏時間的延長，細胞內和細胞間空隙逐漸增大，纖維束逐漸松散，并出現斷裂。微凍貯藏過程中紅鰭東方鲀品質呈變劣趨勢，貯藏1～15 d食用最佳。今后可從微凍過程中感官品質、蛋白質二級結構、氣味物質組成及水分流動性的變化方面開展進一步研究。