多菌種發酵的板栗紅棗果醋品質分析

王夢洋，王大紅，宋鵬輝，原江鋒,3

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)2(河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽，471023)3(東部戰區總醫院 藥理科，江蘇 南京，210002)

板栗營養成分豐富，含有不飽和脂肪酸和黃酮等，被稱為“干果之王”，有活血健脾和減少腫脹等功效[1]。板栗采摘后呼吸強度大，水分流失快，容易發芽或腐爛，造成資源的浪費[2]。目前，我國板栗加工轉化率不足發達國家1/3，因此，高附加值的板栗深加工產業亟待改革[3]。紅棗是一種功能良好的保健果品，有豐富的營養價值和藥用價值[4]，紅棗中富含的多糖以及黃酮類活性物質具有多種生物學功能，可提高機體免疫力、保護肝臟，還具有抗氧化功能[5]。目前我國棗類產品加工工藝簡單，品種單一，已不能滿足向往高生活水平的人們的需求[6]。

果醋是一種具有調節體內酸堿平衡、降低血清膽固醇、抑菌抗氧化等功能的酸性調味品，以果蔬為主要原料，經乙醇、醋酸發酵制成[7-8]。許佳達等[9]以酵母作為紅棗果醋的酒精發酵菌種，優化工藝參數后，產品總酸質量濃度達到46.5 g/L，風味較好。液態發酵法是當前果醋發酵中普遍采用的方法，發酵成品兼備原果汁與果酒的風格與特征[10]，混菌發酵是利用2種或2種以上微生物進行發酵的一種方法。WANG等[11]采用釀酒酵母與巴氏醋桿菌混合發酵，經優化后總酸質量濃度達到66 g/L，比單菌種發酵提高了50%。王陶等[12]采用混菌發酵生產紫薯和杏鮑菇復合果醋，經優化發酵工藝后總酸質量濃度為43.20 g/L，風味及品質良好。本試驗分別選用結果率高、果肉飽滿、耐儲存的河南省信陽市優良板栗品種豫羅紅為主料[13]，選用總黃酮和氨基酸含量較高、核小肉厚、價格較低的新疆哈密大棗為輔料[14]，通過對不同菌種混合發酵的板栗紅棗果醋的多酚、黃酮、有機酸、游離氨基酸、風味物質及其抗氧化能力進行測定及分析，驗證了混合菌種發酵的板栗紅棗果醋是一種營養成分豐富的新型保健飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母、乳酸菌(植物乳桿菌)、增香酵母(異常漢遜酵母菌)和醋酸菌(巴氏醋桿菌)均為本實驗室保存。

表明無蟲眼、無腐爛的豫羅紅板栗，從河南信陽市果農處購買；挑選表面無蟲眼或無腐爛的果粒；棗皮有光澤、褶皺少、無腐爛的新疆哈密大棗。蘆丁、抗壞血酸、沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；L-蘋果酸(≥97%)、D-酒石酸(≥99.5%)、檸檬酸(≥99.5%)、琥珀酸(≥99%)、乳酸，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；7890A氣相色譜儀、5975C質譜儀、HP1100液相色譜儀，美國Agilent公司；A300氨基酸分析儀，德國membraPureGmb公司。

1.3 培養基

酵母培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，水1 000 mL。

乳酸菌培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，檸檬酸二銨2，吐溫-80 1 mL，CH3COONa 5，K2PO42，MgSO40.2，MnSO40.2，水 1 000 mL。

醋酸菌培養基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉10，無水乙醇30 mL，水1 000 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 板栗紅棗果醋發酵鍵步驟

(1)板栗紅棗汁的制備：從市場選購板栗和紅棗，板栗煮熟后將果肉加水打碎得板栗勻漿，紅棗去核后加水打碎得紅棗勻漿，將二者以體積比10∶1混合(設為CK2)。

(2)酶解工藝：耐高溫淀粉酶添加量0.017 5%(質量分數)，90 ℃處理50 min；糖化酶添加量0.001 5%(質量分數)，55 ℃處理30 min；果膠酶添加量為0.015%(質量分數)，50 ℃處理2 h，4層無菌紗布過濾，100 ℃滅菌10 min，備用。

(3)種子液的制備：釀酒酵母和增香酵母30 ℃培養24 h，乳酸菌37 ℃培養48 h，巴氏醋桿菌28 ℃、120 r/min搖床培養48 h，得到相應種子液。

(4)酒精發酵：分別采用釀酒酵母(設為V1)，釀酒酵母+增香酵母(體積比為7∶3，設為V2)，釀酒酵母+增香酵母+乳酸菌(體積比為7∶3∶10，設為V3)3種發酵方式，接種量10%(體積分數)，30 ℃發酵5 d。

(5)醋酸發酵：巴氏醋桿菌接種量10%(體積分數)，28 ℃發酵7 d。

1.4.2 果醋營養成分測定

多酚、黃酮、多肽和VC含量的測定分別參考文獻[15-18]進行，沒食子酸、蘆丁和牛血清蛋白的標準曲線分別為：y=6.92x+0.004 4(R2=0.999 2)，y=0.814 9x-0.003 2(R2=0.999 0)，y=0.125 7x+0.005 1(R2=0.999 1)。

1.4.3 有機酸的測定

采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法進行測定。

樣品處理：將醋樣以10 000 r/min離心10 min，將上清以0.22 μm濾膜過濾后待測。

測定條件：4.6 mm×250 mm×5 μm TSKgel ODS-100V色譜柱，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，溫度40 ℃，波長220 nm，流動相為體積分數0.1%磷酸。測得各標準品的方程和相關系數如表1所示。

表1 各有機酸的回歸方程及相關系數Table 1 Regression equations and correlation coefficients of various organic acids

1.4.4 游離氨基酸測定

樣品處理：取400 μL樣品與100 μL體積分數為10%磺基水楊酸于離心管中混勻，于4 ℃靜置60 min后以10 000 r/min離心15 min，上清液再以15 000 r/min離心5 min后以體積比1∶4將其稀釋，用0.22 μm濾膜過濾。

測定條件：流速180 μL/min，進樣量20 μL，反應溫度70 ℃，柱溫40 ℃。用HW-2000軟件對結果進行分析得到樣品中游離氨基酸的種類和含量。

1.4.5 風味物質分析

采用頂空固相微萃取-氣相-質譜聯用(head space-solid phase micro extraction-gas chromatography -ass spectrometer，HS-SPME-GC-MS)方法。取5 mL醋樣與2 g NaCl加入樣品瓶中密封，60 ℃平衡30 min，50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取頭頂空吸附40 min后GC解吸3 min。

色譜條件：30 m×0.25 mm×0.25 μm DB-WAX毛細管色譜柱，進樣口溫度250 ℃，載氣(He)流速0.8 mL/min，分流比30∶1，升溫程序：30 ℃保持3 min，5 ℃/min升至90 ℃，10 ℃/min升至240 ℃，保持7 min。

質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，發射電流200 μA，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，質量掃描30～450 amu。以NIST和Wiley圖譜庫檢索進行定性分析，單個化合物的相對含量用其峰面積相對總峰面積的百分比表示。

1.4.6 抗氧化能力分析

羥自由基(·OH)清除率[15]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除率以及還原能力測定根據參考文獻[15]中的方法進行。

2 結果與分析

2.1 不同菌種發酵對果醋中多酚、黃酮、多肽和VC含量的影響

板栗和紅棗中含有豐富的營養成分，其中多酚具有保護身體細胞和組織免受損害、延緩細胞衰老、加強免疫系統、促進血液循環和心臟健康等功效[15]；黃酮有降低膽固醇以及抗氧化的作用[19]；多肽類物質對人體具有非常重要的調節作用[20]。目前，國內的果醋市場中，品種較多，其中市場占有率高、消費人群較廣的為蘋果醋[21]，如天地壹號蘋果醋，而市場上未出現板栗紅棗果醋產品，故本試驗選用市售某品牌發酵蘋果醋(CK1)和發酵前的板栗紅棗汁(CK2)為對照。結果如圖1所示，V1、V2和V3中黃酮和多酚的含量高低為V3>V2>V1，V1、V2、V3中多酚的質量濃度比CK2高24%、26%和30%，黃酮含量也高于CK1，但比CK2低，而多肽和VC含量低于CK1和CK2。說明在發酵過程中多酚的含量得到增加，黃酮、多肽和VC的含量有所降低，說明果醋在一定程度上改善了原果汁的營養成分比例。

圖1 不同菌種發酵的板栗紅棗果醋營養成分Fig.1 Nutritional components of Chinese chestnut red jujube vinegar fermented by different bacteria注：V1為2菌種發酵果醋；V2為3菌種發酵果醋；V3為4菌種發酵果醋；CK1為市售蘋果醋；CK2為板栗紅棗汁(下同)

2.2 有機酸含量分析

由圖2可知，乙酸含量V1>V2>V3，檸檬酸含量V2>V1>V3；乳酸只有在V3樣品中被檢測到，質量濃度為0.90 g/L；琥珀酸在V2和V3中被檢測到，V2中質量濃度為7.15 g/L，高于V3。V1、V2和V3中的揮發性有機酸占比分別為95.29%、74.02%、87.83%，以釀酒酵母發酵的果醋中具有最高的揮發性有機酸含量。在這3種果醋中，含有的酒石酸、蘋果酸和琥珀酸可以增加板栗紅棗果醋的風味；乳酸和檸檬酸可以很好地調節板栗紅棗果醋的口感[22]。

圖2 不同菌種發酵的板栗紅棗果醋有機酸含量對比Fig.2 Organic acid contents of Chinese chestnut red jujube vinegar fermented by different strains

2.3 游離氨基酸分析

由表2可知，3種果醋和CK2中20種游離氨基酸總質量濃度分別為28.56、18.37、19.83和75.94 mg/L，8種必需氨基酸占總游離氨基酸的比例分別為30.74%、31.03%、35.1%和16.28%，說明發酵后必需氨基酸的比例大幅度提高。3種發酵果醋中含量最高的氨基酸分別為L-Gly、L-Arg和L-Gly，必需氨基酸中含量最高的為L-Lys。CK2中含量最高的為L-Arg、L-Pro和L-Asp，必需氨基酸中質量濃度最高的為L-Val(3.35 mg/L)。通過比較果醋與板栗紅棗汁中氨基酸種類和含量，在發酵過程中新產生氨基酸為L-Cys、L-Glu和L-Cit，多種氨基酸為果醋提供了豐富的營養成分和口感風味[23]。

表2 不同菌種發酵的板栗紅棗果醋游離氨基酸分析 單位：mg/L

2.4 風味物質分析

由表3可知，V1，V2，V3分別含有31、29和28種揮發性化合物。酸性物質占總揮發性成分的比例最高，分別為58.95%、60.44%和55.94%，其中乙酸含量最高，是評價果醋質量的標準之一[24]；醇類次之，分別占比為25.36%、26.50%和22.53%，含量最高的是苯乙醇，主要來自乙醇發酵，有典型的玫瑰和蜂蜜風味[25]；酯類占比為5.71%、2.35%和2.69%，V1中乙酸苯乙酯含量最高，V2和V3中乙酸異戊酯含量最高，2種物質分別含有有甜味和香蕉香味；醛類和酮類占比為1.55%、1.15%和4.40%，3種果醋中均存在含有奶香味的3-羥基-2-丁酮和含有苦杏仁以及堅果香味的苯甲醛[26]。4菌種發酵的果醋酯類、醛類和酮類占比較高，是果醋呈現良好風味的物質基礎。

表3 不同菌種發酵的板栗紅棗果醋的風味物質 單位：%(相對含量)

2.5 果醋抗氧化能力分析

由圖3可知，未發酵的板栗紅棗果汁的羥自由基清除率和還原能力最高，V2的羥自由基清除率高于V1和V3；V1的還原能力大于V2、V3和CK1，但低于CK2；3種發酵果醋的DPPH自由基清除水平最高的為V3，比蘋果醋CK1和原果汁CK2提高了34.79%和5.25%。

a-自由基清除率；b-還原能力圖3 不同菌種發酵的板栗紅棗果醋抗氧化能力對比Fig.3 Antioxidant capacity of Chinese chestnut red jujube vinegar fermented by different strains

3 結論

研究以板栗為主料、紅棗為輔料分別采用2、3和4菌種混合發酵果醋，并比較不同發酵方式對板栗紅棗果醋品質的影響。研究發現采用釀酒酵母、增香酵母、乳酸菌和醋酸菌復合發酵效果最佳，總酸質量濃度為56 g/L，果醋中多酚、黃酮、多肽和VC質量濃度分別為0.15、0.49、1.43和0.036 g/L；有機酸含量豐富；游離氨基酸的總質量濃度為19.83 mg/L；HS-HPME -GC-MS鑒定果醋中含28種揮發性風味物質，具有良好的風味物質基礎；羥自由基清除率73.9%，DPPH自由基清除率97.1%，還原能力吸光值0.858，抗氧化能力良好。本研究為板栗紅棗果醋的品質分析提供了基礎數據，同時為該果醋的開發提供了參考依據。