甜橙油納米乳液的制備與表征

彭群，段翰英，王超

(暨南大學 食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

甜橙油是重要的食品添加劑及化工原料，目前主要用作制備乳液的載體油，其乳液廣泛應用于食品飲料、化妝品、日用品等行業[1-2]。甜橙油是一類復雜的有機化合物，包含200多種化學物質成分，主要成分為檸檬烯和芳樟醇，屬于萜烯類[3]。這些小分子物質賦予天然香味，并且其多樣化功能如抗菌性、抗氧化、抗炎性、抗癌以及抗乙酰膽堿酯酶的潛力使其在工業化生產上有更廣泛的應用[4-5]。但是這些小分子物質易揮發，在食品的加工和貯藏過程中易受光、熱、氧氣影響產生不愉快的味道，并且大都是親脂性的，所以在水體系的產品比如飲料中表現出較低的溶解度，而低溶解性限制了其在食品行業中的廣泛應用[6-8]。因此，目前亟待找到能提高甜橙油在食品環境中的穩定性的方法，并在需要時控制其釋放，這是芳香化合物和香料公司開發利用的一個轉折點，而納米乳化技術是提高其溶解度和風味保護的最基本的方法之一[9]。

納米乳化技術是將水相與油相混合，利用高壓均質或凝聚等方法制備成納米乳液的技術[10]。其中，乳化劑的種類是影響納米乳液穩定的最重要因素[10]，而天然乳化劑(如磷脂、蛋白質、多糖和皂苷類)逐步替代合成乳化劑已成為趨勢。茶皂素是一種天然的非離子型表面活性劑，其表面活性參數為0.06%，具有良好的起泡能力和泡沫穩定性[11]，但作為乳化劑在食品工業中的應用還很有限，也未見其在甜橙油乳液制備中的應用。為形成更穩定的納米乳液，在實際生產過程中，往往會油相中加入增重劑增加油相的密度，從而降低油相與水相之間的密度差。松香甘油酯是一種常用的增重劑，它是由精制木松香與非動物性來源的甘油通過酯化作用生成[12]。而松香甘油酯的添加量對乳液的穩定性表現出關鍵性的影響[13]。在前期實驗過程中以茶皂素作為乳化劑制備甜橙油穩定性納米乳液時，發現甜橙油和松香甘油酯在乳液中的含量對乳液平均粒徑和穩定性影響顯著。因此，本文采用超高壓微射流技術制備甜橙油水包油納米乳液，利用響應面分析探討了甜橙油和松香甘油酯含量對乳液平均粒徑、多分散指數(polydispersity index，PDI)、濁度、濁度損失率和D-檸檬烯氧化率的影響，以期為以小分子綠色乳化劑制備具有高穩定性的甜橙油納米乳液產品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗材料

甜橙油，廣州百花香料股份有限公司；松香甘油酯，武漢遠成共創科技有限公司; 茶皂素，上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷(HPLC級)，天津市科密歐化學試劑有限公司；環己酮(>99.5%，GC級)，上海麥克林生化科技有限公司；蒸餾水。

1.1.2 主要儀器設備

T25 Basic ULTRA-TURRAX高剪切混合器, 德國IKA-Werke公司；Nano DeBEE高壓微射流機, 美國BEE公司；Nano ZS納米激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；LA-950激光散射粒度分析儀，日本Horiba公司；GENESYS 10S紫外可見光分光光度計，美國Thermo Scientific公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技；PL203電子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水包油納米乳液的制備及工藝優化

以甜橙油和松香甘油酯含量為2個因素，以平均粒徑、PDI、濁度、濁度損失率和D-檸檬烯氧化率作為評價指標，利用響應面分析對水包油納米乳液的制備工藝進行優化，以制備出高穩定性的甜橙油水包油納米乳液。

經前期單因素實驗得到，甜橙油含量(質量分數)為4%～8%、松香甘油酯含量(質量分數)為1%～2%對乳液的平均粒徑、理化性質和穩定性等表現出顯著的影響，因此以4%～8%和1%～2%分別作為甜橙油和松香甘油酯含量的優化范圍，優化實驗的因素水平如表1所示。

按照設定的不同比例將甜橙油和松香甘油酯在室溫下攪拌2 h至混合均勻，即油相；同時將質量分數為2%茶皂素溶于蒸餾水攪拌至完全溶解，即水相。之后再將油相緩慢均勻加入水相中，同時在室溫下用高剪切混合器在9 500 r/min的轉速下混合3 min，混合均勻后得到粗乳液，之后高壓微射流機調節壓力為22 000 psi (1 psi=6.895 kPa)，均質2次，收集所得到的乳液于4 ℃密封冷藏。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Response surface experiment design factor level table

1.2.2 平均粒徑和粒徑分布的測定

新鮮乳液制備好后，通過激光粒度儀測定平均粒徑和粒徑分布。最優乳液于4 ℃貯藏60 d，每5 d取1次樣測定其平均粒徑。測定方法：將激光粒度儀設置好測量參數條件，校正調零后，用膠頭滴管吸取制備好的乳液，滴加到激光粒度儀的樣品池中，超聲30 s待紅色條示數達80%時開始乳液粒徑的測定，3次重復。

1.2.3 PDI的測定

新鮮乳液的PDI制備好后通過納米激光粒度儀測定。最優乳液于4 ℃貯藏60 d，每5 d取1次樣測定其PDI。測定方法∶乳液用50倍體積的蒸餾水稀釋避免多次散射效應，設定儀器測定方法和程序后直接放入樣品池測定，3次重復。

1.2.4 濁度和濁度損失率的測定

用分光光度計測定稀釋乳液濁度，濁度用吸光度值表示。將新制備的乳液用100 g/L的蔗糖溶液稀釋100倍，稀釋后備于100 mL離心管中,4 ℃冰箱中放置30 d，每天取樣。取1 mL乳液于比色皿中，在600 nm處測定其吸光度值。100 g/L的蔗糖溶液作為空白，3次重復測定。對于每一份乳液，吸光度值與儲藏時間遵循一級反應[14]，反應方程如公式(1)所示：

lnA=lnA0-K1t

(1)

式中：A0，乳液貯藏第1天測定的吸光度值；A，乳液貯藏第t天測定的吸光度值；t，貯藏時間，d；K1，一級反應斜率即濁度損失率。K1越小表明乳液越穩定，貨架期越長。當A=0.1A0時，乳液出現破乳，如分層等現象。濁度損失率是評價乳液在高度稀釋的條件下混濁穩定性或乳液破乳速度的一個指標[14]。

1.2.5D-檸檬烯的氧化率的測定

甜橙油乳液氧化穩定性的測定是以新鮮乳液4 ℃密封冷藏30 d后氧化檸檬烯的變化量為表征，即D-檸檬烯的氧化率，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：D，D-檸檬烯氧化率；O1，乳液貯藏第1天測定的氧化檸檬烯生成量；O30，乳液貯藏第30天測定的氧化檸檬烯生成量；C1，乳液貯藏第1天測定的D-檸檬烯含量。

測定方法參照YANG等[15]的方法并稍作修改,取1 mL 乳液加入2 mL二氯甲烷，超聲10 min，吸取下層液體，加入1 μL環己酮作為內標，過濾膜至進樣小瓶，密封，進行下一步GC-MS分析。同時配制3個平行樣測定。GC-MS設定升溫程序為：初始溫度為40 ℃，保持4 min，8 ℃/min升至220 ℃，保持5 min，之后以10 ℃/min升至240 ℃，保持0 min。樣品進樣量為1 μL，不分流。

1.3 數據統計與分析

利用Design-Expert (Version 8.0.6)對響應面實驗進行線性回歸和方差分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 響應面實驗結果

2.1.1 二次回歸模型與方差分析

濁度損失率=0.025+0.007 409X1+0.016X2-0.003 6X1X2

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

由方差分析表(表3)可知，實驗選取的甜橙油納米乳液的平均粒徑的二次回歸模型顯著(0.019 2)，PDI、濁度、濁度損失率和D-檸檬烯氧化率的二次回歸模型極顯著(0.001 5、0.000 2、0.000 3、0.000 7)、失擬項都不顯著(0.057 7、0.097 1、0.132 1、0.901 7、0.102 1)，說明模型預測值與實際誤差較小，即回歸模型能夠較好地預測各個相應的響應值。各個響應的R2值分別為：平均粒徑0.807 0，PDI 0.910 2，濁度0.947 8，濁度損失率0.860 8，D-檸檬烯氧化率0.929 3。R2值都大于0.8，說明模型與實際擬合較好，二次回歸方程可以較好的擬合甜橙油含量和松香甘油酯含量與乳液平均粒徑、PDI、濁度、濁度損失率和D-檸檬烯氧化率之間的關系，所以這5個二次回歸模型對甜橙油納米乳液的這5個變量進行預測是可靠的。

表3 線性回歸方差分析Table 3 Analysis of variance and regression coefficients

2.1.2 各因子對響應值的影響

圖1-a描述了甜橙油和松香甘油酯含量的變化對乳液平均粒徑的影響。乳液的平均粒徑隨著甜橙油含量的增加而增加。由于甜橙油的含量增加導致乳化劑不足以完全覆蓋在所有的油滴表面，同時油滴之間相互碰撞的頻率增加，使得無數的細小液滴聚集形成較大的液滴導致乳液粒徑增加[16]。另外，甜橙油中主要成分檸檬烯相對于甘油三酯含有較高的水溶解度[17]，因此當甜橙油含量增加，奧氏熟化現象越容易產生從而導致乳液液滴聚集形成大液滴，乳液粒徑變大。隨著松香甘油酯含量的增加乳液的粒徑顯著降低。松香甘油酯通常用于飲料乳劑中作為增重劑避免重力分離導致乳液的不穩定[13]，并且由于其疏水性會降低奧氏熟化現象的發生幾率[18]，從而避免了粒徑的增加。隨著松香甘油酯含量的增加，油相的密度與黏度也增加，液滴的流動性降低，因此液滴粒徑的增加受到阻礙。

圖1-b描述了甜橙油和松香甘油酯含量的變化與乳液PDI之間的關系。PDI是評價納米乳液分散性的指標，其數值越小，說明分散性越好。提高甜橙油的含量乳液的PDI顯著增加，粒子分散性變差。提高松香甘油酯含量的乳液PDI顯著降低，粒子分散性變好。這是因為隨著油含量的增加，乳液中油相與水相的密度差隨之增加，乳液越容易出現分層，粒子分布越不均勻。同理，隨著松香甘油酯含量的增加，乳液的流動性降低，阻止小液滴向大液滴聚集，并且降低了油相與水相的密度差，弱化了重力分離導致乳液分層的影響，所以粒子分散性越好。

圖1-c, 圖1-d描述了甜橙油和松香甘油酯含量的變化對乳液濁度和濁度損失率的影響。松香甘油酯含量變化對乳液濁度的影響不大，而甜橙油含量的增加導致濁度顯著增加。這是因為油滴的增加加速了液滴的絮凝并改變了油相和水相的折射率，這與BUFFO等[14]的研究結論一致。另外，在松香甘油酯含量較低時，乳液濁度損失率隨著甜橙油含量的增加而增加;而在松香甘油酯含量較高時，乳液濁度損失率隨著甜橙油含量的增加而降低。且甜橙油在任何比例下，乳液濁度損失率隨著松香甘油酯含量的增加而降低。一般情況下，飲料乳劑的濁度損失率越低,其混濁穩定性越高，相應地，消費者的感官評價也會更高[14]。

圖1-e描述了甜橙油和松香甘油酯含量的變化對乳液氧化穩定性的影響。隨著甜橙油含量的增加，乳液的D-檸檬烯氧化率顯著增加；隨著松香甘油酯含量的增加，乳液的D-檸檬烯氧化率顯著降低，即氧化穩定性顯著提高。事實上，油滴周圍形成的表面活性劑層起著阻隔作用，減少油滴和氧化劑之間碰撞，從而降低檸檬烯的氧化速率[19-20]。但是由于橙油含量增加導致沒有足夠乳化劑覆蓋住油滴,致使界面上油滴漂浮，小油滴聚集成大油滴,加速了與外界氧化劑的接觸面積,從而導致更多的D-檸檬烯被氧化成氧化檸檬烯，乳液產生不愉快的風味。而松香甘油酯的添加提高了液滴的疏水性，減少了氧氣的溶解，避免了檸檬烯的氧化，從而提高了穩定性。

2.1.3 回歸模型的優化與驗證

通過響應面實驗結果可得到制備甜橙油納米乳液的最優參數，即最小納米粒徑、最低PDI、最小濁度損失率和最低D-檸檬烯氧化率。根據優化結果分析，最優工藝條件為：甜橙油質量分數4.05%，松香甘油酯質量分數2.17%，優化預測值為平均粒徑154.3 nm、PDI 0.171、濁度0.300、濁度損失率0.007 7 A/d、D-檸檬烯氧化率0.63%。在最佳條件下，進行3次平行實驗，得到平均粒徑(130.8±1.4)nm、PDI 0.178±0.010、濁度0.322±0.001、濁度損失率(0.007 2±0.002 3)A/d和D-檸檬烯氧化率(0.69±0.00)%。結果表明，預測值與實驗值接近，表明回歸模型是有效的。

為檢驗響應面模型的準確性和有效性，對優化條件點和另2個在范圍內的條件點進行了實驗驗證，其參數條件、實驗數據和百分比誤差如表4所示，各個響應的預測值和實驗實際值的百分比誤差分別為15.2，-3.5，-7.2，12.9，-9.4(平均粒徑，PDI，濁度，濁度損失率，D-檸檬烯氧化率)，實際值與預測值具有較好的擬合性，則此模型得到證實。

a-平均粒徑; b-PDI c-濁度; d-濁度損失率; e-D-檸檬烯氧化率圖1 甜橙油含量和松香甘油酯含量對甜橙油納米乳液性質的影響Fig.1 Effect of sweet orange oil and ester gum content on the properties of sweet orange oil nanoemulsion

表4 響應面模型的驗證Table 4 Validation of the response surface model

2.2 最優乳液的粒徑分布和貯藏穩定性

圖2和圖3分別為最佳條件下制備的乳液的粒徑分布圖和乳液在4 ℃ 60 d貯藏條件下的平均粒徑和PDI變化，結果表明，最優乳液在60 d后的平均粒徑變化不明顯，其平均粒徑<140 nm，PDI<0.3，并且在4 ℃ 60 d貯藏后相比另外2份乳液懸浮較少，幾乎無白色環的出現，表現出了較好的動力學穩定性(圖4)。

圖2 最優乳液粒徑分布圖Fig.2 The droplet-size distribution curve for the emulsion under optimal condition

圖3 最優乳液(含4.05% 甜橙油和2.17% 松香甘油酯)平均粒徑和PDI變化(4 ℃貯藏60 d)Fig.3 Changes in the mean droplet size and PDI for the emulsion during 60 days of storage at 4 ℃

#1～#3分別對應表4序號1～3a-貯藏前；b-貯藏后圖4 三份乳液在4 ℃ 60 d貯藏下的懸浮穩定性Fig.4 Creaming stability of 3 kinds of emulsions during 60 days storage at 4 ℃

3 結論

通過響應面實驗建立了茶皂素乳化制備甜橙油納米乳液的回歸模型，根據方差分析和響應曲面圖，松香甘油酯含量對乳液平均粒徑、PDI、濁度損失率和D-檸檬烯氧化率影響極顯著(P<0.01)，甜橙油含量對乳液平均粒徑影響顯著(P<0.05)，對乳液PDI、濁度、濁度損失率和D-檸檬烯氧化率影響極顯著(P<0.01)，其交互作用對乳液的濁度損失率影響極顯著(P<0.01)。根據建立的多元回歸模型在實驗條件范圍內進行預測，實驗值于預測值吻合度較好。茶皂素乳化穩定甜橙油納米乳液的優化條件為：甜橙油含量(質量分數)為4.05%，松香甘油酯含量(質量分數)為2.17%，在該條件下利用超高壓微射流技術(均質壓力為22 000 psi和均質2次)制備甜橙油納米乳液的平均粒徑為(130.8±1.4) nm，PDI 為0.178±0.010，濁度為0.322±0.001。該乳液經4 ℃ 30 d的貯藏后濁度損失率為(0.007 2±0.002 3)A/d和D-檸檬烯氧化率為(0.69±0.00)%，且其乳液粒徑分布呈現良好的分散性，在4 ℃、60 d內的貯藏過程中表現出平均粒徑<140 nm，PDI<0.3，呈現了較高的動力學穩定性。