FQ-PCR方法檢測結核桿菌的應用研究

劉美蘭 福建省順昌縣醫院檢驗科 353200

結核病是一種常見的慢性傳染性疾病，由結核桿菌感染所致，多發于青年時期，潛伏期1～2個月不等，可出現在人體各種器官中，肺部相對多見，多數患者呈慢性發作，主要表現為低熱、乏力、咳嗽、咯血等，對患者正常工作和生活有著較大影響，甚至會危及患者生命安全[1]。這就需要臨床工作者認識到結核病變早期診斷工作的重要性，在此基礎上制定出科學規范的治療方案。結核桿菌檢測被認為是結核病變診斷與治療工作開展的依據，痰涂片和痰培養法是以往檢測結核桿菌的常用方法，以培養法為金標準，盡管存在一定的應用價值，但受耗時長、操作復雜、敏感性差等因素的影響，推廣應用價值不高[2]。熒光定量聚合酶鏈式反應(Flourescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一種新型定量實驗技術，可對待測樣本的初始濃度進行測定，與傳統檢測方式相比，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優勢，逐漸在病原體的檢測中被廣泛應用[3]。為深入探討FQ-PCR在結核桿菌檢測中的作用，我院以收治的部分疑似結核病變患者為研究對象，對FQ-PCR的應用價值進行如下探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月—2019年9月收治75例疑似結核病變患者作為觀察對象。其中男40例，女35例，年齡28～70歲，平均年齡(44.72±6.96)歲。納入標準：(1)存在低熱、乏力、咳嗽、咯血、盜汗、消瘦等結核病變典型癥狀表現；(2)年齡≥18歲；(3)患者對本研究知情同意，自愿參與。排除標準：(1)重要臟器功能異常者；(2)合并其他系統感染者；(3)精神狀態不佳，配合度差者。

1.2 方法

1.2.1 標本收集與處理：標本收集：于患者入院后給予帶蓋無菌樣本盒，告知患者留取痰標本的方式：晨起漱口，咳出1～2口深部痰置入樣本盒送至檢驗科微生物室進行檢測。標本處理：在獲得的痰液標本中加入1～2倍體積的4%的NAOH，振蕩混勻2min，然后室溫放置15min，期間震蕩數次，以保證痰液能完全液化。取1.2ml液化充分的痰液12 000r/min離心3min，棄上清留沉淀，加入1.2ml PBS液，震蕩混勻沉淀，12 000r/min離心3min離心棄上清留沉淀。重復一次洗滌步驟。加入TB提取液混勻沉淀物，95℃熱裂解15min后平衡至室溫，備用。(備注：如果標本黏稠可適當增加痰液化工作液的使用量及延長振蕩混勻時間)加樣，加入提取好的待檢DNA、陰、陽性對照25μl混勻試劑。

1.2.2 儀器和試劑：廈門致善生物科技股份有限公司生產的結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒、檢測儀器為西安天隆科技有限公司生產的多通道熒光定量分析儀，美國BD公司生產的結核桿菌快速培養系統和配套試劑。

1.2.3 痰涂片和快速培養法:痰涂片參照相關標準程序制作痰膜、抗酸染色，并對結果進行判定；痰培養法：用帶有刻度的無菌毛細血管吸取0.5ml經消化洗滌、離心處理的痰液，放置于培養管，另加添加劑0.8ml，在培養儀器中進行培養，按照1次/h的頻率使用熒光強度記憶探測器對培養管內熒光強度進行測定，對結核桿菌生長情況予以判定。

1.2.4 FQ-PCR：待測標本為經離心處理后的沉淀物，參照試劑盒說明書進行DNA擴增，擴增條件：93℃預變性2min，93℃ 45s、55℃ 60s，共進行10個循環的擴增；隨即以93℃變性45s、55℃變性45s進行30個循環的擴增，根據試劑盒說明書進行結果的判定。

1.3 觀察指標 (1)對比痰涂片和FQ-PCR對結核病變和非結核病變的陽性檢出率。(2)以痰培養法為金標準，對痰涂片和FQ-PCR的疾病診斷情況及診斷敏感性、特異性、準確性、漏診率和誤診率進行比較。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0軟件分析所得數據，疾病檢出率和診斷價值經百分數(%)表示和χ2檢驗，P<0.05提示數據有差異。

2 結果

2.1 兩種方式疾病檢出率對比 痰培養法檢測結果顯示，75例疑似結核病變患者中，42例為結核病變患者，33例為非結核病變患者。FQ-PCR對結核病變和肺結核病變的檢出率為95.24%，非結核病變檢出率為90.91%，與痰涂片的80.95%和69.70%相比，有統計學差異存在(P<0.05)，見表1。

表1 兩種方式疾病檢出率對比

2.2 兩種方式疾病診斷價值對比 以痰培養法為金標準，進行痰涂片和FQ-PCR對結核病變檢測結果見表2。FQ-PCR對結核病變的診斷敏感性、特異性和準確性高于痰涂片法，漏診率和誤診率低于痰涂片法(P<0.05)，見表3。

表2 兩種方式疾病檢測結果對比(n)

表3 兩種方式疾病診斷價值對比(%)

3 討論

結核病是多發的慢性傳染性疾病，對患者身心健康有著嚴重影響，多由結核桿菌感染所致。結核桿菌通常累及患者肺部和淋巴系統，也可感染中樞神經系統、循環系統、骨骼、關節和皮膚等組織臟器，引發相應的癥狀表現。流行病學研究顯示[4]，我國結核病發病率僅次于印度，是當前階段乃至今后很長一段時間內重點控制的重大疾病之一。

結核桿菌感染率高，以隱性感染為主，多數感染者發病前往往存在腫瘤、糖尿病、免疫抑制劑使用史、營養不良等基礎病變，肺結核是結核病變中的常見類型，以咳嗽、咯血、低熱、乏力、消瘦為主要表現，也有患者發病過程中癥狀表現典型性不足，影響疾病診治工作的開展[5]。痰培養法和痰涂片是結核桿菌常用的檢測方式，前者為檢測金標準，但細胞壁脂質含量過高使得培養速度減慢，需2～8周方可完成1個培養周期，耗時長，易耽誤最佳治療時機，加重患者原有疾病。痰涂片操作簡便，可行性強，但易受到標本和其他非結核性抗酸桿菌的影響，敏感性較低，易導致假陽性，對結核桿菌的診斷價值不高[6]。

FQ-PCR是近些年新興的檢測技術，可在短時間內將基因片段擴增至原來的數十萬倍甚至是百萬倍，與傳統PCR法相比，在單一檢測試管中進行整個檢測過程，污染小，可自動獲得判定結果，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、可重復進行等優勢，被廣泛應用于臨床檢驗工作中，在病原體的檢測和感染性疾病的鑒別診斷中發揮著重要作用[7]。

本文結果得出，FQ-PCR對結核病變和非結核病變的檢出率高于痰涂片檢查，數據間存在差異(P<0.05)，所得結論與學者張輝等人的研究成果存在一致性[8]；兩種檢測方式對結核病變的診斷敏感性、特異性、準確性、漏診率和誤診率的對比間有統計學差異(P<0.05)，充分體現了FQ-PCR在結核桿菌檢測中的作用。

總之，將FQ-PCR法運用至結核桿菌臨床檢測，快速、簡便。可定量操作，利于提高結核病變檢出率，可作為痰培養法的輔助手段，對結核病變的診斷有著明顯的應用價值。