阻塞性睡眠呼吸暫停患者血清神經肽S水平與微覺醒的相關性研究

盧靜成 楊立新 周寧

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)，主要是指OSA患者夜間睡眠時反復出現上呼吸道塌陷阻塞引起的間斷性低通氣及呼吸暫停，還伴有打鼾且鼾聲不規律、日間嗜睡、夜間反復發生微覺醒、低氧血癥、高碳酸血癥等癥狀。研究OSA相關微覺醒的目的就是為了以后能利用微覺醒好的一方面和改善不利的一方面，對于OSA相關微覺醒的產生具體與哪些相關[1]。國內外研究發現[2-7]，微覺醒可能與神經肽S、呼吸暫停或低通氣、炎癥反應、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等有關。神經肽S (neuropeptide S, NPS)是一種的具有睡眠-覺醒調節功能的神經肽， Xu等[8]關于NPS的研究推測NPS可能是通過丘腦中線核中的NPS受體轉導的促覺醒作用，并且通過多個促覺醒通路表現作用，例如丘腦中線核、連接核、菱形核等。此外還有學者進一步研究發現[9]神經肽S可以縮短非快眼動睡眠、增加微覺醒次數、減少快眼動睡眠轉入非快眼動睡眠的次數、增加非快眼動睡眠的慢波活動度。所以微覺醒與神經肽S息息相關，但是目前尚無OSA相關微覺醒與神經肽S的研究，因此我們選擇利用血清生物學標記物來測量外周血清神經肽S水平，探討OSA相關微覺醒可能的發生機制及NPS在其中發揮的作用。

資料與方法

一、研究對象

1 對象：根據本次試驗的納入標準和排除標準，隨機選擇2018.12.25-2019.5.30因夜間睡眠打鼾、憋氣或白天嗜睡問題來我院就診并行PSG檢測，并依據成人阻塞性睡眠呼吸暫停基層診療指南(2018年)診斷為OSA，且簽署經我院倫理委員會批準的實驗知情同意書的成年OSA患者，其中62例中男性40例(64.51%)，女性22例(35.48%)；平均年齡(44.5±9.71)歲；BMI(26.25±4.78)kg/m2。OSA患者根據PSG檢測出的AHI結果 分為輕、中、重度組，輕度組(5次/h≤ AHI<15次/h )、中度組(15次/h≤AHI<30次/h )及重度組(AHI≥30次/h )。其中輕度組18例(29.03%)，中度組20例(32.26%)，重度組24例(38.71%)。詳細詢問患者現病史、既往史等資料，然后對所有受試者進行Epworth嗜睡量表(Epworth Sleepiness Scale,ESS)測試，并評估日間嗜睡程度。

2 納入標準：(1)自愿參與本次研究，并同意簽署知情同意書。(2)年齡需滿18周歲；(3)因夜間睡眠打鼾、憋氣或日間嗜睡癥狀，并且之前未行體位、無創氣道正壓通氣、口腔矯治器或外科等治療的首診患者；(4)近6個月未服用安眠或者促覺醒類神經藥物；(5)無其它可以引起中樞性、混合型的睡眠呼吸障礙疾病，例如慢性心力衰竭，Chiafi畸形、腦血管意外、腦干新生物及多系統萎縮癥等；

3 排除標準

(1)未簽署知情同意書；(2)未成年或者年齡較大不能自行在本院行PSG監測一晚的患者；(3)有視力及言語障礙不能配合評估Epworth嗜睡量表的患者；(4)近6個月內曾服用抗生素，近一周曾飲酒的患者；(5)患有嚴重臟器疾病，例如腫瘤、腦梗死、腎衰竭等；(6)體內有植入物可影響PSG監測的患者。

二、研究方法

1 Epworth嗜睡量表評分：參照Johns 1991年發表在Sleep雜志上的評估辦法[10]，根據受試者在8種不同情境下的自身情況進行評分，最后各分數累加即是ESS評分。

2 PSG檢測：所有受試者需要接受整夜≥7h的睡眠檢測，本次研究采用的PSG是北京聯合萬泰型號為SW-2000的多導睡眠監測儀器。

3 血清NPS的測定：所有受試者在接受完PSG 監測的次日晨起后，隨即空腹采肘靜脈血4 mL,用無熱原無內毒素的普通試管收集血液，在23℃±2℃的溫度下放置半小時，然后離心(1000×g)15 min，隨即收集上清液體(如果保存過程中出現沉淀需再次離心)后放置于-80℃恒溫冰箱中冷凍保存，注意避免反復凍融。待所有樣本采集完成后,所有樣本采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA )統一檢測。主要設備和試劑包括；試劑盒為美國TSZ公司生產的人神經肽S(NPS)ELISA試劑盒(編號：HG37881)。

三、統計學方法

數據統計學分析采用SPSS24.0軟件進行。 Kolomogorov-Smirnov 檢驗分析數據的分布,正態分布數據使用單因素方差分析 (多組間)、T 檢驗(2 組間)進行比較,而非正態分布數據使用 Kruskal-Wallis (多組間)、 Mann-Whitney 檢驗(2 組間)。相關性采用Pearson相關性分析。正態分布數據使用平均值±標準差表示，非正態分布數據采用中位數(四分位差)表示，P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、 各組受試者一般資料、血清NPS水平及ESS評分的比較

(見表1)對照組和OSA各組在血清NPS水平、ESS評分、BMI均有顯著差異(P<0.01)。且隨著OSA患者病情的加重，血清NPS水平、ESS評分、BMI均增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組受試者一般資料、血清NPS水平及ESS評分的比較

二、 各組PSG相關數據的比較：

表2可以看出各組受試者在AHI、MAI、N1期、N2期、N3期、REM期比例之間的差異均有統計學意義(P<0.05)。中度組的AHI、MAI、N1期、N2期比例均高于輕度組，且差異具有統計學意義(P<0.05)重度組除REM期比例外，AHI、MAI、N1期、N2期比例均高于輕度組及中度組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。OSA各組與對照組比較，AHI、MAI、N1期、N3期、REM期比例之間的差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組PSG相關數據的比較

三、各受試組血清NPS水平與MAI及其他數據的相關性分析：

表3可看出我們發現總OSA組血清NPS水平與MAI(r=0.827)、ESS評分(r=0.692)、BMI(r=0.505)、AHI(r=0.789)、N1期比例(r=0.707)均呈正相關(均P<0.05)，與N2期(r=-0.679)、N3期比例(r=-0.483)呈負相關(均P<0.05)。

表3 各受試組血清NPS水平與MAI及其他數據的相關性分析

四、各受試組MAI與其他數據的相關性分析：

由表4可知OSA患者微覺醒與血清ESS評分(r=0.766)、BMI(r=0.549)、AHI(r=0.782)、N1期比例(r=0.797)均呈正相關(均P<0.05)，與N2期(r=-0.743)、N3期比例(r=-0.617)呈負相關(均P<0.05)。

表4 各受試組MAI與其他數據的相關性分析

討 論

目前發現OSA與多種疾病的密切相關，例如高血壓、2型糖尿病、冠心病、腦梗死、認知功能障礙等多系統侵害，甚至還與孕產婦出現妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、早產等不良母嬰結局有關[11-15]。所以研究OSA相關機制，可以更好的治療和預防OSA及相關疾病。

本次研究發現隨著OSA病情的加重，ESS評分會升高，也就說明患者日間嗜睡癥狀會加重。我們通過PSG發現，OSA患者的睡眠結構紊亂，主要表現在微覺醒次數增多，N1期睡眠比例升高，N2期、N3期及REM期睡眠比例下降。微覺醒的產生對于OSA患者來說，既是睡眠時發生呼吸紊亂時的一種保護機制，也是造成睡眠結構紊亂的原因之一，而OSA微覺醒的具體產生機制尚不明確。目前主要分為化學和機械刺激兩個方向，當前大多數學者認為是呼吸暫停或低通氣所導致的間斷性低氧或高碳酸血癥引起的微覺醒。其可能是通過刺激頸動脈體和主動脈弓中的外周氧化學傳感器，或者通過激活中樞神經內的CO2化學傳感器。但目前關于神經呼吸驅動的研究尚無定論，且無可重復性的結論。以往研究發現，舌咽神經的頸動脈竇支化學感受器可以將動脈血液分壓變化的信號傳遞給孤束核，最終激活延髓的腹側面神經元，而高碳酸血癥可一并刺激位于頸動脈體的外周化學感受器和延髓腹外側淺表附近的中樞化學感受器。關于睡眠-覺醒的研究目前發現，許多神經遞質在睡眠-覺醒中起著重要作用，例如谷氨酸、去甲腎上腺素、組胺、乙酰膽堿等。目前發現NPS是一種具有睡眠-覺醒調結功能的神經肽，最早Xu等[16]通過給大鼠側腦室注射NPS，大鼠的總覺醒時間明顯升高，N1期、N2期及REM期睡眠時間明顯縮短，并且大鼠在被注射NPS后1 h內即可覺醒。而NPS神經元主要分布于藍斑、旁臂核，在下丘腦和杏仁核也有零星表達，人腦橋中絕大多數(84%)NPS受體(NPSR)神經元分布在旁臂核(parabrachialnucleus，PB)[17]。而PB是OSA相關微覺醒的關鍵腦區, 其中被高碳酸血癥激活PB神經元后產生的功能，可能是引起睡眠期間呼吸受損時發生的微覺醒, 當PB神經元參與高碳酸血癥時，它們有助于激活延髓腹外側神經元、膈和舌下神經運動神經元[18]。有研究[19]通過建立從腦橋的旁臂核神經元中敲除谷氨酸轉運蛋白 2(vesicular glutamate transporter 2，Vglut2)基因的小鼠模型，結果發現從旁臂外側核神經元剔除Vglut2基因后的小鼠，會導致因高碳酸血癥刺激引起的微覺醒潛伏期延長，部分小鼠不會微覺醒。而PB內側核Vglut2基因缺失的模型中，高碳酸血癥并沒有對小鼠發生微覺醒產生很大影響，但會使小鼠NREM 期睡眠比例增加。該試驗結果顯示PB外側核中的谷氨酸能神經元對于高碳酸血癥所誘發的微覺醒來說是非常重要的，而PB內側核谷氨酸能神經元的作用則是促進自發性微覺醒。此外，Kaur等[20]進一步證實了外側PB神經元的部分化學基因和光遺傳學活性可導致覺醒，抑制外側PB神經元的光遺傳學即可阻斷高碳酸血癥導致的微覺醒。我們的結果表明，對照組和OSA各組在血清NPS水平之間有顯著差異(P<0.01)。并且隨著病情的加重，OSA患者血清NPS水平也升高。我們進一步研究NPS與微覺醒的關系發現，OSA患者血清NPS水平與微覺醒呈正相關性(r=0.827，P<0.01)，但我們發現輕度組OSA患者血清NPS水平與微覺醒無相關性，而中重度組OSA患者血清NPS水平與微覺醒均呈正相關性(r=0.659，r=0.683，均P<0.01)。輕度組OSA患者發生微覺醒的主要機制可能不是主要通過NPS通路，有研究發現[21]小鼠在敲除NPSR基因后睡眠時間并沒有明顯延長。由此推測NPS可能不是睡眠-覺醒調節過程的唯一神經遞質，NPS可能只有在OSA患者出現低氧血癥或高碳酸血癥并達到一定程度時才會介導睡眠-覺醒調節過程，還有一種可能是通過喚醒或聯合多條其它睡眠-覺醒調節通路。本次研究還發現血清NPS水平還與AHI、N1期睡眠比例呈正相關(r=0.789，r=0.707，均P<0.01)，N2期、N3期睡眠比例呈負相關(r=-0.679，r=-0.4837，均P<0.01)，并且發現OSA患者隨著病情的加重，微覺醒次數增多，淺睡眠N1期明顯增多，深睡眠N3期明顯減少。這與Ahnaou等[9]結果基本一致，NPS可以促覺醒、減少N3期睡眠時間以及減少正常睡眠周期向深睡眠的轉換次數。該研究還發現NPS雖然減少了N3期睡眠時間，但可以通過增加N3期睡眠的慢波活動度，從而改善睡眠質量，以彌補睡眠時間的減少。所以我們大膽推測NPS的作用可能是在達到一定的微覺醒閾值或者高碳酸血癥后才會產生促覺醒作用，從而避免因呼吸暫停或者低通氣造成的不良后果，例如睡眠結構紊亂。但同時也能發揮積極的作用，例如改善睡眠質量。但是究竟NPS是通過何種神經通路產生促覺醒作用的，目前研究尚無定論。除可能是通過刺激PB外側核中的谷氨酸能神經元外，趙正卿等[22]認為可能是通過單胺能系統。關于NPS的促覺醒機制，也有研究推測其效用可能是通過位于丘腦的中線核群表達的NPS受體所介導的。我們推測可能是PB中的谷氨酸能神經元釋放谷氨酸能型號，然后作用于前腦基底、下丘腦外側、丘腦中線部位及大腦皮層丘腦的NPS受體，從而誘發微覺醒。關于其它呼吸相關覺醒神經通路的研究發現延髓 5-HT 神經元有助于正常的覺醒和睡眠中遇到的缺氧的反應。這也說明NPS相關覺醒通路可能只是OSA呼吸相關覺醒神經通路其中的一條。

從臨床價值來看，研究OSA患者NPS與微覺醒的關系是有意義的，可以為我們提供減少睡眠結構片段化、改善OSA患者夜間睡眠時出現缺氧或者高碳酸血癥的反應從而造成各種不良后果提供新的治療方向。目前國內外研究發現[23-24]，部分患者在接受CPAP治療后睡眠結構改善并不明顯，夜間微覺醒次數仍高，患者白天仍有嗜睡癥狀。所以，OSA相關微覺醒機制的研究可以為我們的治療提供新思路，同時指導我們在不同的治療手段中做出最佳選擇，從而讓OSA患者獲得最佳的治療效果。目前已有關于神經肽S受體拮抗劑(RTI-118)的研究報道[25]，他們發現神經肽S受體拮抗劑可以成為治療可卡因濫用的候選治療方案。所以在未來的研究中，可以根據NPS的生物學特點，研制出改善OSA患者夜間頻發微覺醒的藥物。

綜上所述，雖然發現OSA患者血清NPS水平與微覺醒之間具有相關性，但由于受本實驗樣本量較少，受試者來源單一，且未實時監測血清神經肽S水平，從不能判斷在OSA患者夜間發生微覺醒時體內NPS的釋放是在其發生前還是發生后，僅憑血清神經肽S水平尚不能判斷患者微覺醒的狀態，需進一步研究論證。我們在未來的研究中，會擴大樣本量及樣本來源，并且設計出一種可以實時監測神經肽S的方法，從而進一步的探討OSA相關微覺醒與NPS之間的因果關系。