miR-155及IL-35在哮喘患者外周血中的表達及其潛在臨床意義

黃琰 鄒雯 謝林艷 鄭蓉蓉 王一江

資料與方法

一、一般資料

前瞻性的選取2016年1月至2018年12月期間我院收治的哮喘病患者62名為觀察組，同期選取于我院體檢的健康者62名作為對照組。入選標準：1)哮喘患者的診斷符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的支氣管哮喘指南標準；2)患者年齡18～70周歲；3)哮喘病程大于10年者；4)近四周內未使用糖皮質激素(包括吸入類糖皮質激素)或者免疫抑制劑者；排除標準：1)合并肝腎功能不全者；2)合并免疫系統疾病者；3)哮喘合并其它肺部疾病如COPD者；4)存在其它組織器官感染需抗感染治療者；5)凝血功能障礙者；6)既往存在肺部外傷或者手術者；7)哮喘急性加重期或哮喘持續期。兩組患者均對此研究知情并簽署同意書，本研究經本院倫理委員會批準通過。

二、研究方法

1 研究對象外周血的抽取 獲取兩組研究對象空腹時晨外周靜脈血，量約6～8 mL，置抗凝管中，然后放入離心機，以3000r/分的速度離心，離心10 min，分離上清液，然后將上清液放入-80℃保存備用。

2 miR-155含量檢測 采用實時定量PCR檢測兩組研究對象外周血中miR-155含量水平，使用用Trizol 試劑從上述樣本中抽提總RNA，用紫外分光光度計測總RNA含量，A260 /A280值在1.8～2.0之間提示標本方可用。然后對總RNA 進行電泳，反轉錄為單鏈cDNA。最后在熒光定量PCR儀上分別對miRNA-155和U6進行擴增。采用2-△△Ct計算miRNA-155 的相對表達量。

3 IL-35、IL-4及IL-6的監測方法 應用酶聯免疫吸附法試劑盒(酶聯免疫分析儀：Infinite F50,帝肯公司，瑞士；試劑盒，Santa公司 美國)檢測IL-35、IL-4和IL-6的血清含量，具體操作方法按照試劑盒的方法操作。

三、數據統計

結 果

一、兩組研究對象一般資料比較

本研究結果顯示，兩組研究對象在年齡、性別、高血壓、糖尿病等方面無統計學意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

表1 兩組研究對象資料比較

二、兩組研究對象血清miR-155與IL-35水平比較

本研究結果顯示，觀察組患者血清miR-155高于對照組患者，而血清IL-35的含量則顯著低于對照組患者(P<0.05)，在一定程度上說明了miR-155與IL-35參與了哮喘病的發生發展(見表2)。

表2 兩組研究對象血清miR-155與IL-35水平比較

三、 兩組患者研究對象血清IL-4及IL-6水平比較

本研究結果顯示，觀察組患者血清IL-4及IL-6含量水平則顯著高于對照組患者(P<0.05)，在一定程度上說明了哮喘患者血清IL-4與IL-6水平高于健康體檢者，說明炎癥因子參與了哮喘病的發生及發展(見表3)。

表3 兩組研究對象血清IL-4與IL-6水平比較

四、miR-155表達水平與炎癥因子IL-35之間以及IL-35與IL-4和IL-6的相關性

本研究結果顯示，哮喘病患者血清miR-155與IL-35的含量呈負向相關，同時IL-35與IL-4和IL-6呈負性相關性(P<0.05)，說明了miR-155通過影響IL-35、IL-6及IL-4的表達水平參與哮喘病的發生發展(見表4)。

表4 IL-35與miR-155、IL-4及IL-6相關性分析

五、哮喘病患者發生的單因素及多因素Logistic回歸分析

本研究對本組哮喘病的發生進行單因素分析時發現，既往個人過敏史、家屬過敏史及哮喘史、miR-155升高及IL-35水平是哮喘病發生的危險因素(見表5)。 多因素Logistic回歸分析結果顯示，個人過敏史、家屬過敏史及哮喘史、miR-155升高及IL-35水平血清miR-155升高及IL-35水平含量下降是哮喘病發生的獨立危險因素(見表6，表5)。

表5 哮喘病發生單因素分析

表6 哮喘病多因素 logisitic 回歸分析結果

討 論

哮喘病臨床特點包括發作性氣道平滑肌痙攣而導致氣道高張力，從而產生呼吸困難及并發氣道感染的風險[11]。目前緩解臨床氣道痙攣、激素類藥物等對癥治療是該疾病的主要治療方法，但如何從分子甚至是基因的研究，是目前哮喘病研究的重點[12]。

miR-155作為最近的研究重點，其本身作為一種多功能的RNA，主要參與免疫系統的構建。目前證實免疫系統紊亂及其炎癥反應是哮喘病發生的主要病因，前者包括Th1(細胞免疫應答)/Th2(分泌細胞因子介導體液免疫)失平衡，后者則包括IL-35的低表達及IL-4與IL-6因子的異常表達，且兩者之間也存在密切相關性[13]。故miR-155及IL-35的含量表達對研究哮喘的發生發展具有重要臨床意義。

本研究結果顯示，哮喘組患者血清miR-155的含量明顯高于健康者，而IL-35的含量低于對照組患者，其可能機制如下：miR-155通過限制IL-35的表達打破了Th1/Th2的平衡，促進了Th2的活性，進一步產生了IL-4及IL-6等炎癥因子的過度表達，最后對氣道產生了損傷，誘發支氣管哮喘的發生，而本研究結果也顯示了觀察患者炎癥因子IL-4及IL-6的表達高于對照組研究對象，初步證實了miR-155/IL-35途徑參與了哮喘的發生發展，與既往的研究結果一致[14]。

研究證實IL-35作為哮喘病免疫的第一反應因子，其由T淋巴細胞分泌的IL-12家族成員，可通過影響Th2從而改變細胞因子的分泌(IL-4及IL-6)最終參與哮喘發生發展的過程。本研究結果顯示IL-35與IL-4及IL-6存在負向相關性，可見IL-35具有可抑制IL-4及IL-6量的表達，從而調控體液免疫，減少組胺類及炎性物質的釋放，最終緩解臨床癥狀的潛在可能，既往存在類似的報道[15-16]。

本研究結果進一步分析顯示miR-155與IL-35的表達出在負性相關關系，同時Logistic分析顯示miR-155水平升高及IL-35降低是哮喘發生的獨立危險因素，在一定程度上提示了miR-155在一定程度上限制了IL-35的表達，但具體生物學途徑的通路軸，對我們進一步理解miR-155參與哮喘病的發生發展機理是十分必要的。

綜上所述，miR-155通過影響炎癥反應及炎癥因子IL-35、IL-4及IL-6參與了哮喘的病理生理過程，具有重要的臨床研究意義。但本研究為單中心研究且樣本量少，需要多中心大樣本的研究進一步驗證。