海洋微生物宏基因組學研究進展

胡 敏，李 雪，支紅欣，彭 勃,劉雨心,王玉庭,宋思杭

(大慶師范學院 生物工程學院，黑龍江 大慶 163712)

1 引言

海洋是最大的水生生態系統，具有巨大的開發潛力。由于許多微生物處于海洋極端環境中，如高壓、高溫、低溫等，運用傳統的技術很難對這些微生物進行研究，因此利用宏基因組技術可以為海洋微生物多樣性以及生物技術的應用創造新機遇。

1.1 海洋微生物研究進展

海洋真菌屬于海洋微生物的一個重要組成部分。根據國內外研究表明，至今還有20000～40000種真菌沒有被開發和研究。2005年，中山大學生命科學院王書錦在中國黃海、渤海、遼寧近海地區共分離出500多株海洋真菌，并對其中20多種進行鑒定，主要的真菌有青霉屬(Penicillum)、曲菌屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)。

除真菌以外，許多海洋微生物可以產生抗腫瘤活性物質。在遼寧近海地帶的8個地區，薛德林等分離出8株海洋酵母菌、5株海洋真菌，其中真菌中青霉屬菌株HF9601、HF9602、HF9603中有效成分對Hela等細胞有強烈的抑制作用。

在百慕大西洋群島的研究中，發現擬桿菌門的SAR202在可見光海域分布較多，而在海底不可見光海域非常稀少，通過對不同的海域和不同的海水進行分析比對證實了海洋微生物群體的多樣性。運用用宏基因組技術分析珊瑚，發現其含有38%的真菌序列，其他序列包括7%細菌、1%古生菌、2%真核病毒以及3%噬菌體。相信，利用宏基因組技術開發研究更多的不可培養海洋微生物。

1.2 宏基因組學概述

宏基因組，最初是由Handelsman等于1998年提出的，即一個環境中的全部微生物基因組信息。宏基因組學是以環境樣品中的微生物群體基因組作為研究對象，用功能基因篩選或測序分析的手段研究包括不可培養微生物在內的方法。宏基因組提供了一種探知微生物多樣性結構和功能基因的免培方法，是一條尋找新基因及其產物的新途徑。

自然界生物之間彼此依賴，很多微生物很難在實驗室條件下培養。2004年Handelsman發現宏基因組技術可以通過直接提取的方法對微生物的遺傳物質進行分析。2010年Wong發現宏基因組技術可以用于研究功能基因和編碼酶的基因，同時可以用于研究生物合成過程的生物活性催化劑以及次生物代謝物。2012年，Stewart將細胞培養在多孔的中空纖維膜中，運用組學技術獲取生物多樣性信息。

宏基因組文庫的篩選方式分為功能篩選和測序篩選。功能篩選即生物活性水平的篩選，根據重組克隆產生的新活性進行功能篩選。測序篩選是通過PCR擴增從已知基因的保守片段中識別目標基因。圖1為宏基因組技術操作步驟。

圖1 宏基因組技術操作步驟

2 宏基因組學在海洋微生物中的研究進展

2.1 宏基因組學在海洋微生物新型酶方面的研究

為適應海洋中各種極端環境，某些海洋微生物經演化生成了特殊的代謝產物，可利用宏基因組技術研究新型酶。2012年Cipolla等和Karan等發現嗜冷酶在所有極端酶中具有一定代表性，相比其他常溫酶以及嗜熱酶，嗜冷酶的活性相較之高出10倍多。2013年Fu等在北極潮間帶利用宏基因組文庫篩選分離出Est97的新型嗜冷酯酶，此酶可用于低溫生物轉化。2012年Lee等首次在朝鮮西海岸利用宏基因組文庫分離出具有脂肪酶活性的磷脂酶A。2012年Fang和他的研究團隊從細菌中發現了一種堿性的新型漆酶，該酶可以通過添加含氯化合物增加這種酶的堿性。2012年韓國團隊Jeon等通過宏基因組學發現耐鹽酯酶屬于一種新的酶家族。2013年Wierzbicka-Wos等在波羅的海利用宏基因組文庫篩選BglMKg酶，此酶有β-半乳糖苷酶、β-巖藻糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性。Zhu以及他的團隊于2013年在海洋中發現了解脂酶；2013年Mohamed等從紅海的宏基因組文庫中提取出一種新型酯酶，這種新型酯酶結合了嗜熱活性和抵抗重金屬的能力，可以將其應用到生物修復中。Schroder等于2014年發現了β-葡萄糖苷酶。同時，Schroder等還提取出了具有耐鹽能力的酶。此外， Sayed等于2014年從紅海的樣品中提取一種新型汞還原性酶，它在高溫、高鹽和重金屬條件下有很強的催化能力。

2.2 宏基因組在海洋微生物代謝產物方面的研究

海洋可以稱之為含有大量天然產物的“容器”，這些天然產物很大有藥用價值。2011年Imhoff等發現海洋微生物在不斷繁衍進化的過程中可以產生具有特殊生物活性的次級代謝產物。此外，Asolkar等于2009年、Sakurada等于2010年、Mayer等于2013年分別發現了這些代謝產物對于治療心血管疾病、免疫缺陷以及神經系統疾病有幫助。宏基因組技術對于探索難分離和培養的海洋細菌中的生物活性化合物十分有利。

2.3 宏基因組在篩選海洋微生物化合物方面的研究

2.3.1 測序篩選海洋微生物化合物方面的研究

Piel和他的團隊首次在海綿生物上應用焦磷酸測序技術，提取出非核糖體肽和聚酮合酶基因簇，發現了聚酮類產物(膽酸脂和異戊烯酮)具有抗腫瘤活性，該基因簇由于內含子的缺失和SD序列的存在可以和細菌形成共生體。2004年和2007年Haygood研究團隊運用宏基因組學技術證實了聚酮類物質在pks基因簇中的存在。

一直以來，基因組學的不斷進步為宏基因組技術提供了新策略。單細胞基因組學可以降低宏基因組學的復雜性。2007年Kvist等從復雜的微生物群體中分離出單細胞，再通過測序或 PCR篩選擴增其基因組。2011年Grindberg等利用宏基因組篩選技術分離apr基因簇，這是一種含有抗腫瘤環脂肽Apratoxin A.天然產物的物質。

2.3.2 功能篩選海洋微生物化合物方面的研究

功能驅動篩選法是以活性測定為基礎，通過建立和優化合適的方法從宏基因組文庫中獲得特殊功能的克隆。主要方法有2種：一種是對具有特殊功能的克隆子進行直接檢測，如利用其在選擇性培養基上的表型特征進行篩選，這種方法靈敏度高，較少的目標克隆也能被檢測到；另一種是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功能互補生長的特性進行篩選。功能篩選的優點是不需要生物合成過程中初始化合物的信息。

盡管功能篩選有許多成功的實驗，可仍然存在不足，因為很多基因在異源宿主不能表達。但2012年Ekkers等用鏈霉菌、假單胞桿菌和芽孢桿菌形成的細菌鏈解決了這類問題。此外，陽性克隆子可以通過快速的篩選技術分析大量樣品，Ballestriero等于2010年和Owen等于2012年發現了新的篩選技術，2013年Penesyan等對其方法進行改善，提高其篩選的效率，對未來的功能篩選技術作出貢獻。

2.4 宏基因組學在海洋微生物石油修復方面的研究

一直以來，常用微生物降解石油烴進行海洋石油污染修復，對比其他方法有著無可比擬的優越性。但有些海洋微生物處于極端環境，并且海洋環境中可培養的微生物僅占0.001%～0.1%。宏基因組技術無需培養微生物，可直接從環境中提取微生物的基因組，篩選出低溫環境中活性較高的微生物及新活性物質。因此，宏基因組學在海洋微生物石油修復中有很好的應用前景。2019年Luciana R.Appolinario、DiogoTschoeke、Raphael V.S.Paix?o等在南太平洋利用宏基因組學技術發現了降解石油的微生物的代謝物質。

此外，宏基因組學技術若與其他技術相結合還可以更好地提升海洋石油污染生物修復的效果。總之，宏基因組學可以用于開發新功能的海洋微生物和基因，從而運用于海洋石油污染治理，有十分大的開發潛力。

3 展望

無論是對海洋環境中微生物多樣性的研究，還是發現新型生物活性催化劑或活性化合物的研究，宏基因組技術都可以在這些方面有廣泛的應用前景。由于宏基因組學技術操作簡便，培養技術相對于傳統基因組學培養技術更先進，該技術在測序以及生物信息學分析上有更大的進步空間。

此外， 宏基因組技術在生物資源研究方面有很明顯的優勢，但是由于該技術還不夠成熟，仍然有一些問題需要解決，如：如何高效提取DNA、如何選擇更高效的提取載體以及篩選的方法。因為宏基因組學涉及領域十分廣泛，我們可以將現代分子技術、計算機技術以及生物信息學與宏基因組技術相融合，在各個領域獲得更廣泛的應用。

宏基因組技術在國內外已經有如此廣泛的應用前景，因此各國在海洋生態系統建設方面也都有一定的貢獻。許多實驗項目正在進行當中，主要針對于從極端環境中提取新型海洋微生物，發現一些新型產物，并在健康、醫療、保健等方面有一定突破。目前，研究人員在海洋微生物方面的研究有卓越貢獻，并得到了各國政府的大力支持。