TGF-β1 在慢性高眼壓大鼠視網膜神經節細胞的表達及其抗凋亡作用

高然，陶永健，接傳紅

青光眼是目前嚴重損害視力健康及致盲的常見眼病，到2020 年，全球大約有0.8 億人受青光眼的影響[1]。而視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的凋亡是視功能損傷的主要機制，RGCs 樹突和線粒體的變性可能是青光眼的早期特征[2]，在視網膜神經纖維層變薄之前，RGCs 已經出現了改變[3-4]。目前認為引發凋亡的因素主要有缺血、氧化損傷、多種營養因子缺乏以及神經毒性作用等[5]。控制視神經損傷的重要途徑之一即是抑制RGCs 的凋亡[6]。而轉化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一種廣泛存在于細胞和組織中的多肽生長因子，在胚胎的形成，細胞的分化、生長、增殖、修復、炎癥反應及免疫調節等方面具有不可或缺的作用[7-10]。在神經系統細胞中，TGF-β1 具有抑制神經元細胞的凋亡，促進神經元細胞的存活和分化、軸突生長等重要作用，是突觸重建中細胞支架蛋白的調節因子。此外TGF-β1 還與其他神經營養因子相互作用，促進神經元存活。在腦損傷性疾病中，TGF-β1 充當神經保護劑，進一步抑制細胞凋亡。本文將重點探討在大鼠慢性高眼壓模型中，TGF-β1 在RGCs 的表達及抗凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

正常Wistar 雄性大鼠（購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK (京)2016-0011，SPF 級）54 只（108 只眼），平均體重200±18 g，飼養環境：12 h 晝夜交替，溫度18℃～25℃,濕度40%。本組研究中的所有動物飼養級處理均符合《實驗動物管理條例》。

1.2 試劑及儀器

兔抗大鼠TGF-β1 多克隆抗體（北京博奧森生物公司）；人基因重組TGF-β1 （北京博奧森生物公司）；TRIzol-A+總RNA 提取試劑（日本，TAKARA 公司）；Realtime PCR 試劑盒（日本，TAKARA 公司）；引物(大連寶生物公司)；凋亡試劑盒及復合消化液（武漢博士德公司）；SP 免疫組化試劑盒（北京中杉生物公司）；DAB 顯色液（北京中杉生物公司）；微量注射器（德國，Eppendorf 公司）；顯微手術顯微鏡（德國，Leica 公司）；Tono-PenXL 筆式眼壓計（美國，Reichert公司）；石蠟切片機（德國，Leica 公司）；光學顯微鏡及照相裝置（德國，Leica 公司）；低溫高速離心機（德國，Eppendorf 公司）；Realtime PCR 擴增儀 （美國，ABI 公司）。

1.3 分組和造模

分組： 用隨機數字表法將54 只健康Wistar 雄性大鼠分為3 組，正常組：正常眼壓大鼠6 只（12 只眼）；模型組：普通高眼壓大鼠24 只（48 只眼）；干預組：TGF-β1 抗體干預高眼壓大鼠24 只 （48 只眼）。后兩組根據觀察時間分為1 周、2 周、3 周和4 周組，各6 只（12 只眼）。

造模：將實驗動物標記，稱重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g 腹腔注射，大鼠麻醉后，排除患有眼前節疾病，氧氟沙星眼藥水沖洗眼部，5-0 絲線做眼瞼牽引縫線拉開眼瞼。顯微鏡下，以穹隆為基底，距角膜緣外2 mm 處剪開球結膜，分離筋膜，暴露鞏膜的上方、顳側的鞏膜上靜脈，用熱凝器燒灼封閉鞏膜上靜脈。將浸有0.2 mg/ml 絲裂霉素的棉片置于鞏膜面約1 min，立即予10 ml 生理鹽水沖洗，再用10-0 絲線縫合，將球結膜復位，用復方妥布霉素地塞米松眼膏涂術眼以防止感染。TGF-β1 抗體干預高眼壓組，在造模開始前，用自制玻璃毛細管連接微量注射器，在上直肌和外直肌中間，自睫狀體平坦部向后方以45°角穿刺進入玻璃體腔，注射TGF-β1 抗體50 ng，注射后，用燒灼器燒灼封閉穿刺口。眼壓用Tono-PenXL筆式眼壓計測量，測量3 次，取平均值。測量分別于造模術前、術后即刻和處死前進行。

標本制作：在預定時間，無菌條件下，摘除大鼠左眼，立即置于4%多聚甲醛中，固定2 h 后，沿角膜緣處去除角膜，剪掉晶狀體，再置于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，4 μm 連續切片，備免疫組化和TUNEL 實驗用；無菌條件下摘除大鼠右眼，自角膜緣處剪除角膜，去掉晶狀體，翻轉鞏膜，去除玻璃體，小心完整取出視網膜，置于EP 管中，-80℃下保存，備Realtime PCR 實驗用。

1.4 免疫組化SP 法檢測TGF-β1 蛋白的表達

實驗中常規脫蠟水化，3%H2O2孵育阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS 洗滌3 min×3 次，檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復，冷卻至室溫，PBS 洗滌3 min×3次，動物血清封閉，一抗4℃過夜，PBS 洗滌3 min×3次，二抗濕盒孵育10 min，抗生物素蛋白-過氧化酶10 min，DAB 顯色，檢測TGF-β1 蛋白的表達，TGF-β1 免疫組化陽性產物呈棕黃色、細顆粒狀，它主要表達于細胞膜和(或)細胞質。顯微鏡下隨機選擇10 個高倍視野，其中每個視野均計數100 個細胞，根據陽性細胞的百分率，分為4 個等級： 百分率≤5%為0 分，百分率6%～25%為1 分，百分率26%～50%為2 分，百分率＞50%為3 分。將細胞染色強度也分為4 個等級：其中無著色計為0 分，淡黃色計為1 分，棕黃色計為2 分，深棕色計為3 分。將陽性細胞數評分與染色強度評分相加后最后得出綜合評分。最后綜合評分≥4 分為陽性表達，<4 分為陰性表達。

1.5 RT-PCR 法檢測TGF-β1 mRNA 的相對表達量

大鼠RGCs 總RNA 的提取，采用Trizol 一步法，步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行，采用SYBR Green I 熒光染料嵌合法，以構建的RNA 為標準品，對大鼠RGCs 樣品中的TGF-β1 基因和β-actin 基因分別進行定量，檢測各組大鼠RGCs 中TGF-β1mRNA 基因的相對表達量。如果TGF-β1mRNA 及β-actin 的融解曲線均為單峰，則說明PCR 的產物單一，證明其為特異性產物。

1.6 TUNEL 法檢測模型組、干預組RGCs 凋亡率

充分脫蠟、水化，0.01 M TBS 1:200 新鮮稀釋protease K 37℃消化15 min，加標記緩沖液20 μl/片，于濕盒中37℃標記2 h，加封閉液50 μl/片，室溫30 min，去掉封閉液，用抗體稀釋液1:100 稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后50 μl/片加至標本片上，37℃×30 min，用抗體稀釋液1:100 稀釋SABC：取l ml 抗體稀釋液加SABC 10μl，50μl/片加至切片上，37℃反應30 min，TBS 洗滌，DAB 顯色20 min，水洗，鏡下掌握顯色程度，蘇木素輕度復染，0.01 M TBS 洗，蒸餾水洗，脫水，透明，封片。各切片分別測定5 個獨立高倍視野(×400)中的陽性細胞數，進一步換算成標記指數，即為(陽性細胞數/計測細胞核總數)×100%。

1.7 統計學方法

采用SPSS17.0 軟件進行，計量資料以均值±標準差（）表示，同時采用方差分析，t 檢驗行統計學處理，計數資料用率（%）表示，采用卡方檢驗行統計學處理。若P<0.05，認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組RGCs 中TGF-β1 蛋白的表達

將TGF-β1 蛋白在各個觀察時間段的表達情況匯總分析得出,TGF-β1 在正常組RGCs 中陽性率33.33%，模型組75.00%，干預組4.17%；模型組與干預組，χ2=22.301,P=0.000，有統計學意義。正常組與模型組，正常組與干預組比較，無統計學意義（P＞0.05）（表1）。TGF-β1 在模型組、干預組2 周、4 周時的表達見圖1。

表1 各組RGCs 中TGF-β1 蛋白的表達[眼只數（率）]

2.2 各組RGCs 中TGF-β1 mRNA 的相對表達量

圖1 模型組和干預組2 周、4 周時TGF-β1 蛋白的表達（×400）。1A TGF-β1 蛋白的陰性表達；1B 模型組2 周；1C 模型組4 周；1D 干預組2周；1E 干預組4 周。白箭頭指TGF-β1 蛋白表達陽性的細胞

TGF-β1 mRNA 的相對表達量在模型組最高（6.33±4.81），其次是正常組（1.19±0.09），最后是干預組（0.20±0.17）。正常組與模型組比較，t=2.583,P=0.027；模型組與干預組比較，t=3.119,P=0.011；正常組與干預組，t=13.667,P=0.000，均有統計學意義。

2.3 RGCs 凋亡率

模型組RGCs 凋亡率,隨著觀察時間延長，明顯增加，4 周時達到（76.18±5.25）%，各時間點前后比較均有統計學意義（P＜0.05）；干預組同樣具有隨時間延長凋亡率增加的趨勢，4 周時達到 （82.37±2.18）%，各時間點前后比較均有統計學意義（P＜0.05）。

兩組間凋亡率比較，同時間點干預組高于模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 2 組各時間段RGCs 凋亡率比較（，n=6）

表2 2 組各時間段RGCs 凋亡率比較（，n=6）

注：* 與同組其他時間點比較，P＜0.05；# 與同組1 周、2 周比較，P＜0.05；& 與同組1 周比較，P＜0.05

3 討論

TGF-β1 分布廣泛，在體內所有細胞幾乎均可生成，包括結締組織細胞、上皮細胞、內皮細胞、神經細胞、造血細胞等。而在正常視網膜組織中，TGF-β1 主要表達于視網膜內界膜附近，神經纖維層、神經節細胞層及內顆粒層也可見較弱表達。

青光眼患者視功能的損害是RGCs 凋亡的結果。引起RGCs 凋亡的一個重要原因是多種神經營養因子缺乏，因此，提供神經營養因子，成為阻止RGCs 凋亡的一個重要途徑。研究表明，在神經營養因子增多的干預下，RGCs 凋亡的明顯減少[11-12]。而且，TGF-β1 是一種非常強的多功能性細胞因子，具有神經營養和免疫功能，這種特性在受損傷后會增強[13]。體外試驗發現，單獨應用膠質源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)并不能促進高度純化的神經元存活，只有增加了TGF-β1 后，GDNF 的神經營養活性才起作用，而且，體內用TGF-β1 的抗體封閉，可以充分阻斷GDNF對軸突切斷后的神經元的保護作用。Dhandapani等[14]也在體外干預實驗中證實TGF-β1 可抑制神經細胞凋亡；盛蕾等[15]應用大鼠MCAO 模型再灌注損傷后，體外給予TGF-β1 干預，發現神經細胞凋亡數目顯著減少。目前，已知此保護作用的途徑包括降低Ca2+濃度，穩定細胞內鈣及增加Bcl-2 相關死亡因子Bad 磷酸化，減少Bad 蛋白表達[16]。近年來發現TGF-β1 抑制RGCs 的機制與caspase-3 的生物活性有關，它可通過下調caspase-3 的表達活性，從而抑制細胞凋亡。

本組實驗結果表明，TGF-β1 在正常眼壓組RGCs 中有少量表達，在普通高眼壓組，眼壓升高時，引起內源性TGF-β1 表達升高，在前2 周時，表達增強尤為顯著，作為一個神經營養因子和抗凋亡因子，這是機體抵御RGCs 凋亡的自我保護機制。但是隨著高眼壓持續的時間延長，TGF-β1 的表達也逐漸減弱，RGCs 凋亡也越來越重。

在TGF-β1 抗體干預高眼壓組，采用TGF-β1 抗體干預，使TGF-β1 表達受到抑制，此時RGCs 凋亡的更加嚴重，視網膜組織的病理結構也顯示RGCs層顯著變薄。在缺乏了TGF-β1 表達的高眼壓組，失去了TGF-β1 的神經營養和抗凋亡作用，RGCs 凋亡的明顯加重。

RGCs 的凋亡在2 周時，RGCs 的數目逐漸減少，節細胞層的組織變得疏松，核周間隙增寬。內核層可見少部分細胞固縮，染色加深，少量空泡形成。4周時，內層視網膜組織明顯變薄萎縮，而RGCs 大部分消失，殘留少量固縮核，形狀不規則。

本實驗表明，TGF-β1 可能作為一種神經營養因子或者抗凋亡因子可以阻止視網膜神經節細胞的凋亡。

綜上所述，TGF-β1 在正常眼壓組RGCs 中有少量表達。在高眼壓早期，可以引起內源性TGF-β1 表達升高，實現機體抵御RGCs 凋亡的自我保護機制。隨著時間的延長，這種保護機制逐漸減弱，RGCs 凋亡越來越嚴重。缺少了TGF-β1 的表達，在眼壓增高的同時，RGCs 凋亡的數量也增多，表明TGF-β1 可能作為一種神經營養因子或者抗凋亡因子，可以進一步阻止RGCs 的凋亡。