抑制石榴枯萎病菌的化學農藥和木霉菌株篩選

馬麗婷，魯海菊，羅玉端，胡 婕，李昱賢

（1.紅河學院生命科學與技術學院，云南蒙自 661199；2.蒙自海關綜合技術中心，云南蒙自 661199）

石榴（Punica granatum）是云南重要的經濟林果之一。蒙自萬畝石榴園享有“中國石榴之鄉”的美譽。近年來，由于石榴栽培越來越集中，樹齡越來越大，石榴病害日漸嚴重，石榴枯萎病是其中最嚴重且最難防的病害之一。石榴枯萎病是一種毀滅性土傳植物真菌病害，其病原菌是甘薯長喙殼(Ceratocystis fimbriata)。[1,2]每年4—5月、8—9月為兩次發病高峰期，植株感病后葉片黃化、萎蔫，植株從根到主干木質部橫切面變為褐色，1周后整個植株萎蔫死亡。[2-3]該病害在中國由劉云龍[2]等首次報道云南蒙自發生石榴枯萎病以來，日益加重，至今仍未找到有效的防治措施。根據文獻記載，2004年發病率上升至15.0%，經濟損失達1500萬以上。[4]且發生石榴枯萎病的石榴園再植健壯的石榴苗也很難成活，石榴枯萎病可導致整個果園的毀滅，[5]嚴重影響了蒙自石榴產業的可持續發展。目前許多學者針對石榴枯萎病進行研究，據報道，毛忠順等研究26種化學農藥對石榴枯萎病菌的抑制作用，認為枯萎必克、倍得豐、萬霉靈、大佳托、果病靈和20%三唑酮 6 種化學農藥可作為田間防效研究的備選農藥。[6]經袁陽等研究表明，氟菌·氟環唑-大蒜復配對石榴枯萎病有很好的防治效果。[5]諸多研究者對生防菌進行研究發現，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[7]、公牛鏈霉菌(Streptomyces tauricus)[8]、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[1]、壯觀鏈霉菌（Streptomyces spectabilis）[9]均對石榴枯萎病菌有拮抗作用。大薊石油醚提取物，[10]木姜子乙醇提取物，[11]苦參、黃連、細辛、板藍根、蘆薈等的提取物，[12]枯草芽孢桿菌YZS-B15和HB菌株及熒光假單胞桿菌YZS-Ph02菌株[13]均對石榴枯萎病菌具有很好的抑制作用。

木霉（Trichodermaspp.）菌是一種普遍存在的真菌，是重要的生防因子。木霉菌通過分泌產生細胞壁降解酶類和次級代謝物、營養競爭等方式，進行重寄生等作用，[14]拮抗其他植物病原菌。經魯海菊等研究表明，枇杷內生木霉P3.9菌株對枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsissp.)、辣椒黃萎病病菌(Verticilliumdahliae.)、辣椒黑斑病病菌(Alternariasp.)、萬壽菊葉斑病病菌(Alternariasp.)、康乃馨根腐病病菌(Fusariumsp.)和仙客來根腐病菌(Fusariumsp.)等6種植物病原菌有不同程度的抑菌作用。[15]綜上，木霉P3.9等菌株對石榴枯萎病菌是否有抑菌作用，值得我們去探討。石榴枯萎病危害面積不斷擴大，至今仍然沒有明確有效地田間防治措施。由于化學農藥易產生抗藥性，更新換代較快，有必要篩選抑菌效果較好的新農藥。此外，石榴枯萎病生物防治僅限于原核微生物及植物提取物，木霉是否對石榴枯萎病菌有抑制作用，至今未見報道。鑒于此，本試驗篩選抑制石榴枯萎病菌的化學農藥和木霉菌株，為石榴枯萎病的田間防治提供有效的化學農藥及生防菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

石榴枯萎病病原菌甘薯長喙殼(Ceratocystis fimbriata)、木霉（Trichodermaspp.）菌株：J1、PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3、GD1、GM6、PZ1、抗氟硅唑PZ1、J3、抗三唑酮GD1、Y2、抗三唑酮Y2、抗三唑酮GM6、抗氟硅唑GM6、抗三唑酮PZ1、J5、PY2、J4、JD3、GD3、GD5，庫存于紅河學院生命科學與技術學院植物病理學實驗室。

1.1.2 供試化學農藥

表1 供試化學農藥相關信息

1.1.3 供試培養基

PDA：馬鈴薯 200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1000 mL。以上培養基配好后在121℃高壓滅菌30分鐘。材料均購自農貿市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株的擴繁

將庫存的供試菌株接種到PDA平板上，石榴枯萎病菌于25℃恒溫培養14d，木霉菌于25℃恒溫培養7d。用直徑5mm打孔器取菌塊備用。

1.2.2 測定不同化學農藥對菌絲生長的抑制率

采用菌絲生長速率法，[5]將化學農藥按照使用說明的濃度加到PDA培養液中，搖勻后倒入滅過菌的培養皿中備用。又將供試活化后的石榴枯萎病菌菌塊接種到含化學農藥的培養基平板中央，以石榴枯萎病菌菌塊接種到不含化學農藥的PDA培養基平板中央為對照。每個處理重復3次，28℃下恒溫培養7d后，用十字交叉法[5]測量菌落直徑，記錄菌落擴展情況，并用以下公式計算抑菌率：抑菌率(%)=（對照菌落增長直徑-含藥培養基上菌落增長直徑）/對照增長菌落直徑×100。

1.2.3 測定木霉菌株對石榴枯萎病菌的抑制率

采用對峙培養法，[15]將木霉菌塊與石榴枯萎病菌菌塊兩兩組合，接種到距離平板中央相等的兩個點上，以不接種木霉菌塊作為對照，重復3次，于28℃恒溫培養7d，測定菌落直徑，計算抑制率：抑菌率(%)=（對照菌落增長直徑-含藥培養基上菌落增長直徑）/對照增長菌落直徑×100

1.2.4 數據統計

所得數據用Excel進行匯總，計算平均值和作圖，所有試驗數據均采用 SPSS19.0統計軟件Duncan氏多重比較法進行統計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同化學農藥對石榴枯萎病菌的抑制作用

由圖1可知，經Duncana多重比較發現，咪鮮胺、丙環唑、多菌靈3種化學農藥對石榴枯萎病菌菌落生長差異不顯著，但與其余處理間的差異極顯著，病原菌菌落直徑為0.00mm，抑菌率達100%，抑制效果最好。甲基硫菌靈對石榴枯萎病菌生長的影響與其余處理間差異極顯著，病原菌菌落直徑為7.00mm，抑菌率為63.79%。苯醚甲環唑、氟硅唑、三唑酮、百菌清4種化學農藥抑菌率均小于50%。其中：氟硅唑和三唑酮抑菌差異不顯著，而苯醚甲環唑和百菌清抑菌差異極顯著。綜上，咪鮮胺、丙環唑和多菌靈可作為田間防治石榴枯萎病的首選化學農藥。

圖1 不同化學農藥對石榴枯萎病菌的抑制作用

2.2 不同木霉菌株對石榴枯萎病菌的抑制作用

由圖2可知，經Duncana多重比較發現，PJ1-1、PJ1-2、J2和PJ3 4個木霉菌株對石榴枯萎病菌菌落生長影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑分別為8.83mm、9.00mm、8.67mm和8.83mm，抑菌率均達70%以上。J1木霉菌株對石榴枯萎病菌菌落生長的影響，與PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3 4個菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑為7.67mm，抑菌率為76%，抑制效果最好。PZ1木霉菌株對石榴枯萎病菌菌落生長的影響，與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落平均直徑為10.83mm，抑菌率為66%。GM6、抗氟硅唑PZ1和J3 3個菌株對病菌生長影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑分別為11.77mm、12.00mm和11.88mm，抑菌率為63%。GD1與其余菌株間的影響差異極顯著，病菌菌落直徑為12.5mm，抑菌率為61%。綜上，J1、PJ1-1、PJ1-2、J2、PJ3 5個木霉菌株對石榴枯萎病菌抑菌率70%以上，可作為開發生防菌劑的菌種資源。

圖2 抑菌率在60%以上木霉菌株對石榴枯萎病菌的抑制作用

由圖3可知，經Duncana多重比較發現，Y2、抗三唑酮PZ1和J4 3個木霉菌株對石榴枯萎病菌菌落生長的影響，與其余菌株差異極顯著，病菌菌落直徑分別為13.17mm、13.67mm和17.33mm，抑菌率分別為59%、57%和46%。抗三唑酮Y2和抗三唑酮GM6 2個菌株對石榴枯萎病菌生長的影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病原菌菌落直徑分別為14.67mm、14.50mm，抑菌率為55%。J5和抗氟硅唑GM6對石榴枯萎病菌生長的影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑均為15.83mm，抑菌率為51%。JD3、GD3和GD5 3個菌株對石榴枯萎病菌生長的影響差異不顯著，但與其余菌株間的差異極顯著，病菌菌落直徑分別為20.00mm、19.83mm和19.33mm，抑菌率在38%-40%之間。

圖3 抑菌率在60%以下木霉菌株對石榴枯萎病菌的抑制作用

3 討論

8種化學農藥均對石榴枯萎病菌有抑制作用。其中：首先是咪鮮胺、丙環唑、多菌靈3種農藥的抑菌效果最好，抑菌率高達100%，這與何平[16]等試驗結果相符。其次是甲基硫菌靈，抑菌率為63.79%。苯醚甲環唑、氟硅唑、三唑酮、百菌清4種農藥抑菌作用差且均小于50%。其中：多菌靈對石榴枯萎病菌室內抑菌率為100%與毛忠順[5]等試驗研究結果不一致，二者相差兩倍多。苯醚甲環唑抑制效果差與何平[16]試驗結果一致。三唑酮和百菌清對石榴枯萎病抑制率低與毛忠順[5]等的試驗結果，二者抑菌率相差四倍多，這可能病原菌發生突變、藥劑升級等原因有關。因此，在投入大田使用前應做室內抑菌率檢測。另外，根據張德勝等報載，苦參堿與甲基硫菌靈、百菌清和異菌脲混配使用對甘薯長喙殼的抑制作用均優于單獨使用。[17]今后，防治石榴枯萎病應選擇使用混配劑。

22個木霉菌株均對石榴枯萎病菌具有抑菌作用。抑菌率在22%～76%之間。其中：效果最好的是J1、PJ1-1、PJ1-2、J2和PJ3 5個木霉菌株，抑菌率均達70%以上。根據魯海菊等研究，PJ1-1、PJ1-2、PJ3抗藥性木霉菌株對病原菌的抑菌率高于原始菌株，[18]其中：此次檢測PJ1-1、PJ1-2抑菌率與魯海菊等試驗結果不一致，可能與菌株退化酶活性降低等原因有關。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[1]，板藍根、蘆薈的提取物[12]對石榴枯萎病菌的抑菌作用比此次檢驗表現最好的木霉菌株低5%-20%。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[7]、公牛鏈霉菌(Streptomyces tauricus)[8]、壯觀鏈霉菌（Streptomyces spectabilis）[9]、大薊石油醚提取物[10]，木姜子乙醇提取物，[11]苦參、黃連、細辛的提取物，[12]枯草芽孢桿菌菌株YZS-B15 和HB 及熒光假單胞桿菌菌株YZS-Ph02[13]對石榴枯萎病菌的抑制率比此次檢驗表現最好的木霉菌株高5%-30%。但是，木霉菌和病原菌的相互作用機制在分子水平上有明顯的優勢，木霉菌具有延遲干旱脅迫和抵御病原菌侵害等功能，[19]提高農作物的抗逆性。同時，木霉菌及其代謝產物還能促進植物生長，增加植物對營養物質的吸收利用，提高農產品產量，而且其廣泛存在于大自然，取材方便，成本低。綜上，利用木霉菌株防治石榴枯萎病的方案是可行的。根據文獻記載，木霉菌對黃瓜枯萎病[20]、香蕉枯萎病[21]、蔬菜土傳病害[22]等多種土傳真菌性病害均表現出很好的防治效果，說明木霉菌對土傳真菌病害的抑制具有廣譜性，進一步說明了從22個供試木霉菌株中篩選抑菌率高的木霉菌株來防治石榴枯萎病是可行的。此外，木霉與化學農藥協同防治蘋果輪紋病，[23]木霉菌與三唑酮混配對西瓜枯萎病的防效，[24]木霉菌與多菌靈協同防治灰霉病[25]等試驗表明，菌-藥復配表現出明顯的增效作用，且降低了化學農藥的用量。此次檢驗抗藥性木霉菌株PJ3抑菌率高于原始菌株，且本身的抗藥性可彌補木霉菌株缺乏抗藥能力的缺陷，保證其更好地發揮藥效。但抗藥性木霉菌株PJ3與咪鮮胺、丙環唑、多菌靈3種農藥復配是否具有協同增效作用，有待進一步研究。因此，課題組后期將進一步試驗研究抗藥性木霉菌株PJ3與咪鮮胺、丙環唑、多菌靈等3種化學農藥復配對石榴枯萎病菌的抑制作用。

通過生物防治的方法來抑制石榴枯萎病菌，不僅能達到抗病增產的效果，減少化學農藥的使用，還能減輕農藥殘留。我國化學農藥和肥料過度使用導致生態環境受污染，耕地面積減少、質量退化，農產品農藥殘留量高等現象較為嚴重，社會需要更多無毒無污染的生物農藥來緩解這些問題。木霉菌是較為廣譜且普遍存在的生防菌株，且可防治部分土傳真菌病害，[26]是當前具有較大開發價值及潛力的生防菌株，且其對石榴枯萎病菌的防治作用篩選尚屬首次，有進一步研發利用的價值。