下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療后血清miR-342-5p 水平及其意義

杜自忠， 王 晨， 張明星， 靳金龍， 趙 丹， 馬書平， 白會玲， 章 立

隨著生活方式改變和人口老齡化,下肢動脈硬化閉塞癥發病率逐年升高,我國老年人群罹患率為10%左右［1］。 該病是導致下肢截肢的主要原因之一,占所有截肢患者40%～60%［2］。 血管旁路移植手術和介入治療為目前下肢動脈硬化閉塞癥有效治療方法,但血管旁路手術創傷較大,不適合年齡較大患者,介入治療具有創傷小、術后恢復快、并發癥少等優點,臨床上已廣泛應用［3］。介入治療近期療效較好,但仍有部分患者術后發生再狹窄或需截肢等［4］。因此,早期了解患者預后情況、采取合理干預措施、改善患者預后至關重要。 目前臨床上尚缺乏靈敏、準確的生物標記物評估下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后情況。 微小核糖核酸（microRNA,miRNA,miR）-342-5p 已證實可通過抑制蛋白激酶B 介導的miR-155 表達參與 動脈粥樣硬化過程［5］,但關于miR-342-5p 與下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后的關系未見報道。 為此,本中心開展此項研究,旨在為下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年3 月至2018 年3 月甘肅省中醫院救治的195 例下肢動脈硬化閉塞癥患者作為研究對象。 根據《下肢動脈硬化閉塞癥診治指南》［6］中的標準進行診斷:①下肢涼、麻木、無力、間歇性跛行和靜息痛,肢體缺血性潰瘍、壞疽等；②缺血肢體遠端動脈搏動減弱或消失；③踝-肱指數＜0.9；④趾-肱指數＜0.7。 患者納入標準:①下肢血管CTA 顯示狹窄程度≥50%；②未接受過對癥治療；③愿接受介入治療,年齡≥18 歲；④簽署知情同意書。 排除標準:①伴有惡性腫瘤； ②術后不能堅持口服抗血小板藥物；③有嚴重肝、腎損害；④既往有下肢損傷史；⑤既往下肢手術史；⑥糖尿病足。195 例患者中男113 例,女92 例；年齡40～72 歲,平均（57.43±4.93）歲；體質指數（BMI）為（27.17±3.09） kg/m2。 本研究獲得本院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

抽取患者介入術前及術后12 h 空腹外周靜脈血10 mL,室溫下4 000 r/min 離心15 min,離心半徑8 cm,分離上層血清,置于-20℃冰箱待測。 采用免疫比濁法檢測血清C 反應蛋白（CRP）水平（試劑盒購自北京奧維亞生物技術公司）。

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR）［7］檢測患者血清miR-342-5p 相對表達,TRIzol 試劑（美國Thermo公司）提取總RNA,TaqMan microRNA 逆轉錄試劑盒（美國Thermo 公司）合成cDNA,PCR 擴增。 反應條件為:95℃60 s,95℃15 s,15 s 退火,72℃45 s,40 個循環。以β-肌動蛋白（actin）為內參,采用2-ΔΔCt 表示miR-342-5p 相對表達。 基因序列:miR-342-5p 為F:5'-CCACATTTAAAGGACTGTAT-3',R:5'-AAAAAGCCACATTTAAAGGAC-3'；β-actin 為F:5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3',R:5'-GTCAGTCGCTTGGGCTGT-3'。

介入術后通過電話隨訪或復診等方式進行隨訪（2015 年3 月24 日至2019 年4 月15 日）,記錄患者術后12 個月內預后情況。 術后再狹窄、截肢和死亡,定義為預后不良。 下肢彩色超聲或CT 復查血管狹窄＞50%,定義為再狹窄［8］。

根據CRP 和miR-342-5p 評估介入治療預后的最佳截斷點,將其轉換為二分類變量。 將伴高血壓（否=0,是=1）、伴糖尿病（否=0,是=1）、伴高脂血癥（否=0,是=1）、伴高同型半胱氨酸血癥（否=0,是=1）、吸煙史（否=0,是=1）、泛大西洋學會聯盟（TASC）分型（A、B 型=0,C、D 型=1）以及CRP（＜4.27 g/L=0,≥4.27 g/L=1）、miR-342-5p（＜1.23=0,≥1.23=1）作為自變量,預后情況（預后良好=0,預后不良=1）作為因變量納入logistic 回歸分析。

采用二元logistic 回歸分析建立介入治療預后評估模型A（F=-203.934+0.883×伴糖尿病+0.832×伴高脂血癥+0.657×吸煙史-0.735×TASC 分型+2.824×CRP）和模型B（F=-204.267+0.832×伴糖尿病+0.810×伴高脂血癥+0.837×吸煙史+0.862×TASC 分型+2.911×CRP+5.704×miR-342-5p）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析。 服從正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示,兩組間比較用獨立樣本t 檢驗,治療前后比較用配對樣本t 檢驗。 計數資料用卡方檢驗,以例或率［n（%）］表示。Logistic 回歸法分析影響下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術后復發相關因素。 受試者工作特征曲線（ROC）分析miR-342-5p、模型A、模型B 評估下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術后復發的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

介入治療術后195 例患者中預后良好160 例（82.1%,預后良好組）,預后不良35 例（17.9%,預后不良組）,其中25 例（12.8%）發生再狹窄,8 例（4.1%）截肢,2 例（1.0%）死亡。 兩組患者間年齡、性別、BMI、伴腦血管病、伴冠心病、伴慢性腎功能不全、病變肢數比較,差異無統計學意義（P＞0.05）；伴高血壓、伴糖尿病、伴高脂血癥、伴高同型半胱氨酸血癥、吸煙史、TASC 分型、CRP 比較,差異有統計學意義（P＜0.05）,見表1。 兩組血清miR-342-5p 相對表達比較,治療前差異無統計學意義（P＞0.05）,治療后均降低, 預后良好組降低幅度大于預后不良組,差異有統計學意義（P＜0.05）,見表2。

表1 兩組患者基本資料比較

表2 兩組介入治療前后血清miR-342-5p 相對表達比較fmol/L

Logistic 多因素回歸分析結果顯示, 伴糖尿病、伴高脂血癥、吸煙史、TASC 分型、CRP、miR-342-5p與下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后密切相關,見表3。 二元回歸分析顯示,miR-342-5p 評估介入治療預后曲線下面積（AUC）與模型A 比較,差異無統計學意義（Z=0.078,P=0.938）；模型B 評估介入治療預后AUC 高于miR-342-5p 和模型A,差異均有顯著統計學意義（Z=2.683,P=0.007；Z=4.624,P＜0.001）,見表4～6,圖1。

表3 影響介入治療預后的多因素分析結果

表4 模型A 預測介入治療預后的二元分析結果

表5 模型B 預測介入治療預后二元分析結果

3 討論

下肢動脈硬化閉塞癥由動脈粥樣硬化斑塊形成引起,若不能及時處理,截肢率較高［9］。 介入治療為目前臨床廣泛應用的一種微創手術,雖取得一定療效,但術后再狹窄或截肢等情況時有發生。 因此,下肢動脈硬化閉塞癥患者介入術后預后評估,對改善患者預后具有重要意義。miRNA 是一種非編碼單鏈RNA, 研究顯示miRNA 多方面參與動脈粥樣硬化進展,如內皮功能障礙、炎性細胞浸潤、低密度脂蛋白氧化等［10-12］。 miR-342-5p 在早期巨噬細胞病變中高表達,動物模型和細胞實驗均表明miR-342-5p參與動脈粥樣硬化發生過程［5］。 本研究旨在探討miR-342-5p 與下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后的關系。

表6 miR-342-5p、模型A 和模型B 評估介入治療預后效能

圖1 miR-342-5p、模型A 和模型B 評估介入治療預后的ROC 曲線

本研究顯示,介入治療前下肢動脈硬化閉塞癥患者血清miR-342-5p 相對表達高于治療后, 表明miR-342-5p 可能與下肢動脈硬化閉塞癥患者病情存在聯系； 預后不良組患者血清miR-342-5p 相對表達高于預后良好組, 表明miR-342-5p 可能與患者預后存在聯系。Logistic 回歸分析影響下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后因素顯示, 伴高血壓、伴糖尿病、伴高脂血癥、吸煙史、TASC 分型與介入治療預后密切相關, 該結果與既往研究一致［13-14］；miR-342-5p 與患者介入治療預后密切相關。

炎性因子介導的動脈粥樣硬化與下肢動脈硬化閉塞癥發生、發展密切相關［15］。 研究表明,蛋白激酶B 可通過激活核因子κB 上調巨噬細胞過表達一氧化氮合酶-2［16］。 一氧化氮合酶-2 表達升高,促進血管壁中一氧化氮和超氧化物反應生成氧化亞硝酸鹽,通過此途徑引起高脂蛋白硝化反應及多條代謝信號通路失調,導致代謝產物在血管聚集［17］。 此外,一氧化氮合酶-2 還可引起炎性細胞浸潤,通過炎性反應損傷血管內皮, 引起血管內血栓形成［18］。有研究表明, 通過抑制大鼠miR-342-5p 表達可減少一氧化氮合酶-2 介導的過氧亞硝酸鹽形成［5］。 因此, 本研究推測miR-342-5p 可能通過促進一氧化氮合酶-2 表達, 參與下肢動脈硬化閉塞癥疾病進展。 但關于miR-342-5p 影響下肢動脈硬化閉塞癥疾病進展的病理生理機制,仍需進一步探究。

本研究同時應用miR-342-5p、模型A 和模型B評估下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后,結果顯示模型B 評估介入治療預后效能高于miR-342-5p 和模型A, 表明增加miR-342-5p 更有利于下肢動脈硬化閉塞癥患者介入治療預后的評估。

綜上所述,miR-342-5p 與介入治療后下肢動脈硬化閉塞癥患者預后密切相關,檢測血清miR-342-5p 相對表達有助于評估患者介預后情況。 本研究下一步將動態檢測下肢動脈硬化閉塞癥患者血清miR-342-5p 相對表達, 并分析miR-342-5p影響下肢動脈硬化閉塞癥疾病進展的病理生理機制。