miR-93表達與內鏡黏膜下剝離術治療老年早期胃癌預后的關系及其靶向抑癌基因的生物信息學分析*

楊潔，彭志紅，吳宏博

[陸軍軍醫大學第一附屬醫院（重慶西南醫院）消化內科，重慶400038]

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著胃鏡檢查的普及，早期胃癌的檢出率有所提高，在胃癌局限于黏膜或黏膜下層的早期階段進行治療，能夠明顯改善預后，5年生存率可超過90.0%。內鏡黏膜下剝離術（endoscopic submucosal dissection，ESD）是近年發展起來的治療手段，可以一次性大塊、完整的切除直徑2 cm 以上的黏膜病變，用于早期胃癌的治療能取得組織學治愈性切除，遠期療效理想[1]。也有研究[2]報道，ESD 治療早期胃癌后仍有3.2%的患者存在術后復發的可能；國內劉黎等[3]的臨床研究顯示，胃癌浸潤深度是早期胃癌術后復發的獨立危險因素。因此，對可能復發的高危人群進行早期預警，并給予相應的輔助治療或靶向治療，對改善預后、降低復發率具有積極價值。

微小RNA（micro RNAs，miRs）是在轉錄后水平調節基因表達的非編碼小分子RNA，具有廣泛的生物學效應，與多種惡性腫瘤的發生有著密切關系。相關臨床研究[4]證實，miR-21、miR-25、miR-93 和miR-106b 在胃癌組織中表達增多，其中miR-93 是具有促癌作用的miR；有細胞研究[5-6]證實，miR-93 能夠靶向胃癌細胞中的抑癌基因PTEN和TIMP2，并發揮促癌作用，與其在早期胃癌中高表達的趨勢相吻合。但早期胃癌中高表達的miR-93 是否對術后復發具有預測價值仍未明確。本研究選取接受ESD 的老年早期胃癌患者作為研究對象，分析miR-93 表達與預后的關系，并利用生物信息學初步探究miR-93 的靶向抑癌基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月－2017年12月本院確診為早期胃癌的老年患者268例。其中，男139例，女129例，年齡61～70 歲，平均（62.82±12.95）歲。另取同期在本院接受胃鏡下胃黏膜活檢、經病理證實為正常胃黏膜、且一般資料匹配的受試者95例作為對照組。其中，男55例，女40例，年齡60～67歲，平均（63.34±12.19）歲。早期胃癌患者和正常胃黏膜受試者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①接受ESD治療；②術后病理學檢查診斷為胃癌；③TNM 分期為T1-2N0期；④年齡≥60 歲；臨床病理資料完整；⑤隨訪資料完整。排除標準：①術前接受過放化療；②術后接受放化療；③既往有其他惡性腫瘤病史；④隨訪過程中發生失訪。

1.2 試劑及儀器

miRNA 提取分離試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測試盒購自天根生化科技（北京）有限公司，RIPA 裂解液購自上海碧云天公司，兔單克隆PTEN 和TIMP2 一抗購自Abcam 公司。熒光定量PCR 儀為Bio-Rad 公司，凝膠成像儀為上海勤翔科學儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR 檢測miR-93 的表達取早期胃癌組織和正常胃黏膜組織，使用miRNA 提取分離試劑盒提取組織樣本中的miRNA。使用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒配置反轉錄體系，將miR 反轉錄為cDNA；miRNA 熒光定量檢測試劑盒配置熒光定量PCR 體系：cDNA 2 μL、混合液10.0 μL、10 μmol/L 上游引物0.6 μL、10 μmol/L 通用下游引物0.6 μL、去離子水6.8 μL，在PCR 儀上按照95℃預變性，3 min 后按95℃5 s、60℃15 s 的程序反應40 個循環，根據循環曲線計算miR-93 的表達量。

1.3.2 Western blot 檢測PTEN 和TIMP2的表達取早期胃癌組織和正常胃黏膜組織，加入RIPA 裂解液后充分研磨、提取蛋白，測定蛋白含量后，取30 μg 蛋白樣本進行Western blot 檢測，將蛋白樣本加入SDS-PAGE，電泳后電轉移至NC 膜，5%脫脂牛奶在室溫下封閉NC 膜1 h，1∶1 000 稀釋的PTEN 和TIMP2 單克隆抗體4℃孵育NC 膜過夜；第2天以1∶1 000 稀釋的HRP 二抗孵育NC 膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值計算PTEN 和TIMP2 的表達量。

1.4 術后隨訪

所有早期胃癌患者在術后3 個月內每個月復查1 次，術后3～12 個月則每3 個月復查1 次，1年后每6 個月復查1 次，復查項目包括血常規、生化和胃鏡等。隨訪截止日期2019年10月31日，記錄患者的復發情況。

1.5 生物信息學分析

在Targetscan 網站上進行miR-93 靶向PTEN、TIMP2 的生物信息學分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件錄入數據，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；兩計量資料間的相關性分析采用Pearson 檢驗；復發影響因素采用COX 回歸模型分析；復發率的比較采用Kaplan-Meier 曲線；miR-93 預測復發的價值采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中miR-93、PTEN和TIMP2 表達量比較

與正常胃黏膜組織比較，早期胃癌組織中miR-93 的表達量明顯增加，PTEN 和TIMP2 的表達量明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1 和表1。經Pearson 檢驗，早期胃癌組織中miR-93 的表達量與PTEN 和TIMP2 的表達量呈負相關，相關系數分別為-0.412 和-0.384（P＜0.05）。

圖1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中PTEN和TIMP2的蛋白條帶Fig.1 Protein bands of PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue

表1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達量比較（±s）Table 1 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue（±s）

表1 早期胃癌組織和正常胃黏膜組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達量比較（±s）Table 1 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue（±s）

類別早期胃癌組織（n=268）正常胃黏膜組織（n=95）t值P值miR-93 0.60±0.24 0.41±0.09 7.53 0.000 PTEN 0.52±0.11 0.93±0.18 26.04 0.000 TIMP2 0.45±0.10 1.32±0.32 39.48 0.000

2.2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2 表達量比較

不同性別、年齡患者的早期胃癌組織中miR-93、PTEN 和TIMP2 表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；T2期、低分化和未分化、黏膜下早期胃癌組織中miR-93 的表達量高于T1期、中分化和高分化、黏膜內早期胃癌組織，PTEN 和TIMP2 的表達量明顯低于T1期、中分化和高分化、黏膜內早期胃癌組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissue with different clinicopathological features（±s）

表2 不同臨床病理特征早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissue with different clinicopathological features（±s）

類別性別男（n=139）女（n=129）t值P值年齡≤65歲（n=101）＞65歲（n=167）t值P值T分期T1期（n=98）T2期（n=170）t值P值分化程度中分化和高分化（n=102）低分化和未分化（n=166）t值P值浸潤深度黏膜內（n=182）黏膜下（n=86）t值P值miR-93 0.57±0.22 0.63±0.28 1.96 0.051 0.58±0.21 0.61±0.30 0.88 0.378 0.46±0.17 0.68±0.29 6.86 0.000 0.44±0.19 0.70±0.28 8.28 0.000 0.54±0.16 0.71±0.30 6.05 0.000 PTEN 0.51±0.09 0.53±0.12 1.40 0.162 0.50±0.08 0.52±0.13 1.39 0.164 0.64±0.13 0.45±0.06 16.30 0.000 0.61±0.12 0.46±0.08 12.27 0.000 0.57±0.14 0.42±0.07 9.39 0.000 TIMP2 0.46±0.08 0.44±0.13 1.53 0.128 0.46±0.09 0.44±0.12 1.45 0.149 0.66±0.13 0.33±0.08 26.73 0.000 0.60±0.12 0.36±0.07 20.67 0.000 0.54±0.11 0.26±0.08 21.11 0.000

2.3 復發與未復發患者早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2 表達量比較

與未復發患者比較，復發患者早期胃癌組織中miR-93 的表達量明顯增加，PTEN 和TIMP2 表達量明顯減少，兩者比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 早期胃癌患者術后復發影響因素COX 回歸分析

以是否復發為應變量，性別、年齡、T 分期、分化程度、浸潤深度、miR-93、PTEN 和TIMP2 為自變量，進行COX 回歸分析，結果顯示：黏膜下浸潤、miR-93 表達增多、PTEN 及TIMP2 表達減少是早期胃癌患者術后復發的危險因素。見表4。

2.5 miR-93 預測早期胃癌患者術后復發的Kaplan-Meier 曲線及ROC 曲線分析

根據早期胃癌組織中miR-93 表達量的中位數分為miR-93低表達和高表達，繪制未復發的Kaplan-Meier曲線，與miR-93 低表達患者比較，miR-93 高表達患者的未復發率較低（P＜0.05）；繪制miR-93 表達量預測早期胃癌患者復發的ROC 曲線，曲線下面積為0.7015（95%CI：0.583～0.820），根據約登指數最大值確定最佳截點為0.72，靈敏度和特異度分別為66.02%和66.67%。見圖2 和3。

2.6 miR-93靶向PTEN和TIMP2的生物信息學分析

miR-93 靶 向PTEN 基 因 為mRNA 3’UTR 序 列的第272-278 堿基，靶向TIMP2 基因為mRNA 3’UTR 序列的第1 961-1 967 堿基。見圖4。

表3 復發與未復發患者早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達量比較（±s）Table 3 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissues of patients with and without recurrence（±s）

表3 復發與未復發患者早期胃癌組織中miR-93、PTEN和TIMP2表達量比較（±s）Table 3 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissues of patients with and without recurrence（±s）

類別未復發（n=256）復發（n=12）t值P值miR-93 0.59±0.24 0.76±0.19 2.99 0.003 PTEN 0.73±0.18 0.51±0.07 9.59 0.000 TIMP2 0.88±0.17 0.43±0.06 22.35 0.000

表4 早期胃癌患者術后復發影響因素COX回歸分析Table 4 Cox regression analysis of influencing factors of postoperative recurrence in patients with early gastric cancer

圖2 早期胃癌患者術后復發的Kaplan-Meier曲線Fig.2 Kaplan-Meier curve of postoperative recurrence in patients with early gastric cancer

圖3 miR-93預測早期胃癌患者術后復發的ROC曲線Fig.3 ROC curve of miR-93 in predicting postoperative recurrence of patients with early gastric cancer

圖4 miR-93靶向PTEN和TIMP2的生物信息學分析Fig.4 Bioinformatics analysis of miR-93 targeting PTEN and TIMP2

3 討論

ESD 在早期胃癌的治療中表現出積極價值，具有創傷小、組織學切除徹底等優勢，但仍有部分患者發生術后復發，造成預后不良。因此，篩選可能發生術后復發的高危早期胃癌患者，并盡早在術后進行輔助治療和靶向治療，具有積極的臨床意義。miR-93 是一種具有促癌作用的miRNA，在包括胃癌在內的多種消化道惡性腫瘤中均呈高表達趨勢[7-10]，也有研究[11]表明，早期胃癌血清中miR-93的表達增多。本研究對入組的早期胃癌患者進行了miR-93 表達量的分析，發現早期胃癌組織中miR-93 的表達量明顯高于正常胃黏膜組織，與既往研究結果[9，11]一致，驗證了miR-93 高表達與早期胃癌發生的關系。

miR-93 的促癌作用包括促進癌細胞增殖、遷移和侵襲，胃癌細胞中的PTEN 和TIMP2 已經被證實受到miR-93 調控[5-6]。PTEN 和TIMP2 均是重要的抑癌基因，前者通過抑制PI3K/AKT 通路來抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡[12-13]，后者通過抑制基質金屬蛋白酶的活性來抑制細胞遷移、侵襲[14]。當miR-93表達增多時，能夠抑制PTEN 及TIMP2 的表達，并使細胞凋亡受阻，導致細胞增殖、遷移及侵襲增強。在早期胃癌的病理進程中，癌細胞的增殖、遷移、侵襲與腫瘤病灶的生長、分化、浸潤均密切相關。本研究分析不同病理特征的早期胃癌組織中miR-93 表達的差異，發現T2期、低分化和未分化、黏膜下早期胃癌組織中miR-93 的表達量明顯升高，受miR-93 調控的PTEN 和TIMP2 表達量減少，且miR-93 與PTEN、TIMP2 呈負相關，說明miR-93高表達不僅參與了早期胃癌的發生，還加速了早期胃癌病灶生長、分化程度降低、黏膜下浸潤等病理特征的惡化。進一步在Targetscan 網站進行生物信息學分析可知，PTEN 及TIMP2 基因mRNA 的3’UTR 上含有miR-93 的結合位點，符合miR-93 靶向抑制PTEN 及TIMP2 表達的生物學效應。因此，靶向抑癌基因PTEN、TIMP2 并介導促進增殖、侵襲等生物學效應，可能是miR-93 高表達參與早期胃癌發生發展的分子機制。

已有研究[15-16]報道，腫瘤病理特征是早期胃癌患者術后復發的影響因素；劉黎等[3]臨床研究顯示，胃癌浸潤深度及原癌基因β-catenin、抑癌基因E-cadherin 表達異常是早期胃癌術后復發的獨立危險因素。本研究對早期胃癌患者ESD 后復發情況進行隨訪及分析，復發的早期胃癌患者中miR-93 表達增加，而抑癌基因PTEN、TIMP2 表達減少，提示：miR-93 及受其調控的PTEN、TIMP2 表達異常，可能與早期胃癌術后復發有關。進一步通過COX 回歸模型驗證，黏膜下浸潤、miR-93 表達增多、PTEN 及TIMP2 表達減少均是早期胃癌術后復發的危險因素；黏膜下浸潤作為危險因素、與劉黎等[3]報道一致；miR-93 高表達、PTEN 及TIMP2 表達減少作為危險因素，與相應的生物學功能吻合。

miR-93 的促癌作用被廣泛證實，可能在癌細胞惡性生物學行為中處于上游調控地位，通過調控下游包括PTEN、TIMP2 在內的多種靶基因來增強癌細胞惡性生物學行為。因此，miR-93 表達的改變，可以通過復雜的下游機制來造成早期胃癌的發生發展，同時也影響遠期預后，造成局部復發。在COX回歸模型驗證了miR-93 表達增加與早期胃癌術后復發的關系后，本研究還通過Kaplan-Meier 曲線及ROC 曲線分析了miR-93 預測復發的價值，結果顯示，miR-93 高表達的早期胃癌患者術后復發率更高，且miR-93 的表達對早期胃癌術后復發具有預測價值。因此，miR-93 的表達可能成為預測早期胃癌術后復發、篩查早期胃癌術后復發高危人群的標志物，也可能成為治療早期胃癌、預防復發的治療靶點。

綜上所述，早期胃癌中miR-93 表達增多與病理特征惡化、抑癌基因PTEN 及TIMP2 表達減少以及ESD 術后復發有關；miR-93 高表達是早期胃癌患者ESD 術后復發的危險因素，對術后復發具有預測價值，靶向抑癌基因PTEN 和TIMP2 是其可能的生物學作用。本研究的不足之處是隨訪時間較短，今后將進一步延長隨訪時間，并深入挖掘miR-93在早期胃癌發生發展中的作用及可能機制。