miR-328-5p靶向SPON2介導FAK/Src信號調控胃癌細胞遷移和侵襲的機制研究

馬君 陳洋 牟一平

胃癌是世界上第二大癌癥死亡的原因，在包括中國和日本在內的亞洲國家中，胃癌的發病率特別高。據報道，全球范圍內盡管胃癌的發病率在逐年下降，但每年仍有超過100萬的新診斷病例和85萬的死亡病例[1]。胃癌高病死率的主要原因在于其早期無明顯臨床癥狀，多數患者確診時已處于晚期，導致臨床治療效果不佳，預后差[2]。大量文獻表明，異常miRNA表達與胃癌的發生和發展密切相關[3-4]。近年來有研究顯示，miRNA可通過干擾腫瘤抑制因子和促進癌基因的表達導致功能異常，這與胃癌的發生密切相關[5]。此外，miRNA的功能障礙還可導致下游表型的變化，包括細胞遷移、侵襲、增殖和凋亡等過程[5]。miRNA可通過與靶基因完全或不完全結合導致靶mRNA降解。多項研究發現長鏈非編碼RNA或者環狀RNA通過調控miR-328-5p的表達參與非小細胞肺癌、卵巢癌等多種腫瘤的惡性進展，并有希望成為臨床診斷的標志物[6-7]。然而其在胃癌中的作用尚未見報道，基于此，本研究將探討miR-328-5p對胃癌細胞遷移和侵襲的作用及其具體的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 30只雄性C57BL/6J小鼠（體重：22～25g，年齡：6～7周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證：北京 SYXK（京）2017-0033。小鼠自由飲水進食，晝夜各12 h。人源胃黏膜上皮細胞系GES-1以及胃癌細胞系SGC7901、MKN28均購自上海澳音生物科技有限公司。miR-328-5p和miR-con（批號：121547）均購自上海美軒生物科技有限公司；Transwell小室（批號：845116）購自吳江康寧生命科學有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號：215548）購自武漢純度生物科技有限公司；脊椎蛋白2（SPON2）兔單抗（批號：s1121）、波形蛋白（Vimentin）兔單抗（批號：s87516）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）兔單抗（批號：s8361）均購自武漢三鷹生物技術有限公司，酪氨酸蛋白激酶（Src）兔單抗、磷酸化 Src（p-Src）兔單抗（批號：b2158）、局部黏著斑激酶（FAK）兔單抗（批號：b0542）、磷酸化 FAK（p-FAK）兔單抗（批號：b9564）均購自杭州戴格生物技術有限公司，GAPDH作為內參。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及胃癌模型構建 將30只小鼠按照隨機數字表法分為胃癌組和正常組，每組15只。胃癌組小鼠采用N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）化學誘導法構建小鼠胃癌模型，具體操作為：在小鼠飲用水里添加MNU，以120 mg/L濃度持續處理4周，即可誘導小鼠胃組織發生癌變[8]。

1.2.2 小鼠胃組織中miR-328-5p、SPON2相對表達量檢測 取兩組小鼠胃組織，提取RNA，進一步逆轉為cDNA，采用RT-PCR法檢測miR-328-5p、SPON2相對表達量。引物購自上海生工生物工程股份有限公司。反應程序：94℃變性 20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環數32個。其相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3 小鼠胃組織中p-Src、Src、p-FAK、FAK蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取小鼠胃癌及正常胃組織，采用強組織蛋白裂解液裂解胃癌及正常胃組織蛋白，采用BCA法檢測兩組蛋白濃度，定量后取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜后利用5%的牛奶室溫封閉1 h去除非特異性抗原，隨后加入對應配制好的一抗中于4℃孵育過夜，抗體稀釋比均為1：1 000。次日利用辣根過氧化物酶化學二抗室溫孵育1 h后進行化學曝光，利用化學掃膜儀分析數據。

1.2.4 胃癌細胞分組培養及轉染 將胃癌細胞系SGC7901置于1640完全培養基（1640基礎培養基+10% FBS+1%雙抗）中進行培養，細胞密度達到80%～90%時進行傳代鋪板。將細胞分為miR-328-5p組、miR-con組、NC組共3組。其中miR-328-5p組細胞轉染miR-328-5p，miR-con組細胞轉染miR-con，NC組不轉染。將SGC7901細胞鋪板于6孔板中，按照lipo 2000說明書進行轉染，轉染6 h后換液，24 h后消化細胞進行后續實驗。

1.2.5 3組胃癌細胞miR-328-5p、Vimentin和MMP-9表達水平檢測 細胞按照上述分組處理24 h后，提取細胞RNA，采用RT-PCR法檢測miR-328-5p、Vimentin、MMP-9相對表達量，其相對表達量采用2-△△Ct法計算，以U6作為內參。每組實驗設計6個復孔。

1.2.6 3組胃癌細胞遷移、侵襲數檢測 采用Transwell小室實驗。細胞按照上述分組處理24 h后，用胰酶消化細胞，經過離心后采用無血清基礎1 640培養基重懸計數后，稀釋成4×106個/ml的細胞懸液，取100 μl鋪板于 Transwell上室，下室加入 600 μl含血清完全培養基。上下室共培養24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min后，用棉簽將上室未遷移的細胞擦拭干凈，結晶紫染色，拍照計算細胞遷移數。細胞侵襲實驗則提前將Transwell上室包被基質膠，后續操作同遷移實驗步驟，拍照計算細胞侵襲數。每組實驗設計6個復孔。

1.2.7 miR-328-5p、miR-con胃癌細胞SPON2基因野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶相對活力值檢測 采用熒光素酶報告基因實驗。Targetscan 7.2軟件分析miR-328-5p直接靶向SPON2基因3′UTR序列后，設計該靶點突變報告基因質粒。報告基因實驗分為miR-con+SPON2 WT組、miR-328-5p+SPON2 WT組、miR-con+SPON2 MUT組、miR-328-5p+SPON2 MUT組共4組，其中miR-con+SPON2 WT組細胞轉染miR-con和SPON2 WT質粒，miR-328-5p+SPON2 WT組細胞轉染 miR-328-5p和 SPON2 WT質粒，miR-con+SPON2 MUT組細胞轉染miR-con和SPON2 MUT質粒，miR-328-5p+SPON2 MUT組轉染miR-328-5p和SPON2 MUT質粒。質粒轉染24 h，取出細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒裂解細胞并進行后續實驗，最后用酶標儀檢測并計算熒光素酶相對活力值。每組實驗設計6個復孔。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠胃組織中miR-328-5p、SPON2相對表達量比較 與正常組比較，胃癌組胃組織中miR-328-5p相對表達量明顯降低，SPON2相對表達量明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠胃組織中miR-328-5p、SPON2相對表達量比較

2.2 兩組小鼠胃組織中p-Src、Src、p-FAK、FAK蛋白表達水平比較 與正常組比較，胃癌組胃組織中p-FAK、p-Src蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 磷酸化酪氨酸蛋白激酶（p-Src）、酪氨酸蛋白激酶（Src）、磷酸化局部黏著斑激酶（p-FAK）、局部黏著斑激酶（FAK）蛋白表達的電泳圖

表2 兩組細胞p-Src、Src、p-FAK、FAK蛋白表達水平比較

2.3 3組胃癌細胞miR-328-5p、Vimentin和MMP-9相對表達量比較 與NC、miR-con組比較，miR-328-5p組miR-328-5p相對表達量明顯升高，同時Vimentin、MMP-9相對表達量均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 3組細胞miR-328-5p、Vimentin和MMP-9相對表達量比較

2.4 3組胃癌細胞遷移、侵襲數比較 與NC、miR-con組比較，miR-328-5p組細胞遷移數和侵襲數均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表4。

表4 3組細胞遷移、侵襲數比較（個）

2.5 4組胃癌細胞熒光素酶相對活力值比較 與miR-328-5p+SPON2 WT組比較，miR-con+SPON2 WT組、miR-con+SPON2 MUT組、miR-328-5p+SPON2 MUT組熒光素酶相對活力值均明顯為高，差異均有統計學意義（均 P＜0.05）。見圖 2、表 5。

圖2 miR-328-5p靶向SPON2基因3'UTR序列

表5 miR-328-5p對SPON2雙熒光素酶報告基因熒光素酶相對活力值檢測

3 討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其特征是進展迅速、預后差和5年生存率低。迄今為止，早期檢測胃癌是降低胃癌病死率的最佳方法。由于內鏡檢查存在相關的不良反應（包括穿孔，吸入性肺炎或出血），因此內鏡檢查在社區中并不普及。因此，尋求獲取方便、易于檢測的生物標志物將有利于胃癌的早期檢測[9]。

miRNA參與調控包括細胞增殖、轉移、分化、發育等多種生物學過程。越來越多的證據表明，多種miRNA在癌組織和正常組織中差異表達，并對miRNA在各種類型癌癥中的分布進行了分析，提出了miRNA在臨床應用中的診斷和預后價值[10]。對于miR-328-5p此前已有文章報道miR-328-5p可通過靶向糖基化終產物受體抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖[11]，此外CircRNA-5692可通過刺激miR-328-5p增強殘疾基因同源物2相互作用蛋白表達從而來抑制肝癌的進展[12]。長鏈非編碼RNA TPTEP1競爭性抑制miR-328-5p從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。本研究通過構建小鼠原位胃癌模型，發現miR-328-5p在胃癌組織中表達明顯低于正常胃組織，而SPON2在胃癌組織中表達明顯高于正常胃組織。通過遷移和侵襲實驗發現過表達miR-328-5p可抑制胃癌細胞遷移和侵襲。通過Targetscan分析發現miR-328-5p可能靶向SPON2 3′UTR序列，該結論進一步通過熒光素酶報告基因得到驗證。

SPON2是一種細胞外基質蛋白，由SPON2基因編碼，早期研究發現與SPON2相關的疾病包括藥物誘導的紅斑狼瘡，探其致病機制發現SPON2主要影響整合素活化及蛋白質代謝[13-14]。近年來SPON2在腫瘤中的作用越來越得到重視，在大腸癌中，SPON2表達明顯上調，并通過缺口受體信號參與腫瘤的惡性進程[15]。本研究發現miR-328-5p靶向SPON2后可能通過調控FAK/Src信號通路的活化，抑制了Vimentin、MMP-9等細胞遷移相關分子的表達。

綜上所述，本研究發現miR-328-5p在胃癌中表達下調，過表達miR-328-5p抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力，分子機制研究發現miR-328-5p可能通過靶向抑制SPON2的表達，從而抑制了FAK/Src信號的活化及下游細胞遷移相關蛋白Vimentin、MMP-9的表達。因此miR-328-5p有望成為胃癌臨床診斷標志物和治療靶點。