miR-455對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制研究

唐文波 王霖霖 楊雪 陳藕景

據(jù)統(tǒng)計(jì)，10%～15%的育齡期女性患有子宮內(nèi)膜異位癥[1]。子宮內(nèi)膜異位癥的病因存在多種假說[2-4]，但是至今尚未達(dá)成一致。有研究提示氧化應(yīng)激可能通過誘發(fā)腹膜腔內(nèi)的廣泛炎癥反應(yīng)參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生過程[5]。因此，抑制氧化應(yīng)激或許是治療子宮內(nèi)膜異位癥的方式之一。miRNA是一類在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制蛋白翻譯和促進(jìn)mRNA降解調(diào)控基因表達(dá)的短片段非編碼RNA[6]。miRNA參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，其中包括氧化應(yīng)激[7-9]。研究表明miR-455通過激活Nrf2信號通路對成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用[10-11]。然而，至今尚不明確miR-455是否能夠減輕人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（human endometrial stromal cell，HESC）的氧化應(yīng)激。脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4）是一種15kDa大小的脂蛋白，參與多種生物學(xué)過程[12]。研究表明，F(xiàn)ABP4在脂肪細(xì)胞中降低了氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，敲除FABP4基因可引起細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高[13-14]。這說明FABP4在氧化應(yīng)激調(diào)控中扮演重要角色，其是否在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用呢？基于此，本研究首先確認(rèn)miR-455是否為一種潛在的FABP4靶向miRNA，再通過過表達(dá)miR-455來研究其對過氧化氫誘導(dǎo)的HESC毒性的保護(hù)作用，并進(jìn)一步通過沉默和過表達(dá)FABP4調(diào)控miR-455的表達(dá)來研究miR-455調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HESC購自上海佰曄生物科技中心。DMEM培養(yǎng)液為美國HyClone公司產(chǎn)品。miR-455模擬物（miR-455 mimics）、陰性對照 mimics（miR-NC）、FABP4 siRNA（si-FABP4）和 pcDNA3.1-FABP4（pcFABP4）、兩段包含突變型和野生型FABP4基因3′UTR序列的寡核苷酸序列、雙熒光素酶試劑盒均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞凋亡率檢測試劑盒、ABI 7500 PCR儀、ELISA酶標(biāo)儀均購自賽默飛世爾科技公司。miScript SYBR-Green PCR試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HESC培養(yǎng)于含10% FBS及100 U/ml青鏈霉素的DMEM與Ham’s F-12混合培養(yǎng)基，置于含5%二氧化碳的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，2～3 d換液1次。細(xì)胞轉(zhuǎn)染通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒完成。轉(zhuǎn)染過程：取50 pmol的miR-455 mimics，加入一定量的無血清稀釋液，充分混勻，制成RNA稀釋液，終體積為 25 μl。取 1 μl的 Lipofectamine 2000，然后加入24 μl無血清稀釋液體，充分混勻，制成稀釋液，終體積為 25 μl。室溫靜置 5 min。將 Lipofectamine 2000 稀釋液和RNA稀釋液充分混合，室溫靜置15 min。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。將50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到有0.45 ml全培養(yǎng)基（含有10%血清和抗生素）的細(xì)胞上，混合均勻。轉(zhuǎn)染6 h后觀測細(xì)胞狀態(tài)，如狀態(tài)良好則不必更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測 采用CCK-8法。HESC以5 000/孔的密度接種于 96 孔板。經(jīng)不同濃度（0、5、10、20 μmol/L）過氧化氫溶液干預(yù)24 h后，加入10 μl CCK-8試劑，采用ELISA酶標(biāo)儀檢測波長595 nm處的OD值，以沒有接種細(xì)胞的孔作為空白對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上取平均值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡情況檢測 采用Annexin V-FITC/PI對HESC染色后，通過流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。Annexin V-FITC陰性、PI陰性為存活細(xì)胞，Annexin V陽性PI陰性為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC陽性、PI陽性為晚期凋亡細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞miR-455表達(dá)水平檢測 采用實(shí)時定量PCR（qPCR）法。采用Trizol試劑從HESC中提取總RNA。取1 μg總RNA采用TIANscriptⅡ cDNA合成試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，采用miScript SYBRGreen PCR試劑盒在ABI 7500 PCR儀中完成qPCR反應(yīng)。GAPDH和U6作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃1 min，（95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s）×40 循環(huán)。根據(jù) 2-ΔΔCt法計(jì)算 HESC miR-455 表達(dá)水平[15]。

1.2.5 miR-455靶點(diǎn)篩選與驗(yàn)證 采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TargetScan和StarBase V2.0。為檢測FABP4是否為miR-455的直接靶點(diǎn)，將FABP4的3′-UTR插入pmir－GLO雙熒光素酶miRNA靶表達(dá)載體中（野生型MT），第二種載體中，假定miR-455在FABP4的3′-UTR中的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變（突變型Mut），并插入到pmirGLO載體中。通過轉(zhuǎn)染方法使HESC過表達(dá)miR-455，從而觀察兩種載體FABP4 3′UTR的熒光素酶活性。通過轉(zhuǎn)染si-FABP4成功抑制HESC FABP4的表達(dá)，另將miR-455 mimics和FABP4過表達(dá)載體單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染HESC，使HESC中miR-455和FABP4過表達(dá)。比較沉默F(xiàn)ABP4的HESC與空白對照的HESC，及FABP4、miR-455聯(lián)合過表達(dá)的HESC與過表達(dá)miR-455的HESC存活率、凋亡率，方法同1.2.2、1.2.3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HESC加入不同濃度過氧化氫溶液中培養(yǎng)24 h后凋亡率比較 見圖1。

圖1 人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（HESC）加入不同濃度的過氧化氫溶液培養(yǎng)24 h后凋亡率比較（a：流式細(xì)胞圖；b：細(xì)胞凋亡率比較）

由圖1可見，與0 μmol/L濃度過氧化氫溶液處理的 HESC 比較，5、10、20 μmol/L 濃度過氧化氫溶液處理的HESC凋亡率上升（均P＜0.05）。

2.2 HESC加入不同濃度過氧化氫溶液中培養(yǎng)24 h后miR-455表達(dá)水平比較 見圖2。

圖2 人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（HESC）加入不同濃度的過氧化氫溶液中培養(yǎng)24 h后miR-455表達(dá)水平比較

由圖2可見，與0 μmol/L濃度過氧化氫溶液處理的 HESC 比較，5、10、20 μmol/L 濃度過氧化氫溶液處理的HESC miR-455表達(dá)水平均下降（均P＜0.05）。

2.3 過表達(dá)miR-455的HESC與空白對照的HESC存活率、凋亡率比較 見圖3。

圖3 過表達(dá)miR-455的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（HESC）與空白對照的HESC存活率、凋亡率比較

由圖3可見，20 μmol/L濃度過氧化氫溶液處理后，與空白對照的HESC比較，過表達(dá)miR-455的HESC存活率上升、凋亡率下降（均P＜0.05）。

2.4 miR-455的潛在靶點(diǎn)篩選結(jié)果 采用生物信息學(xué)工具TargetScan和StarBase V2.0篩選miR-455的潛在靶點(diǎn)，顯示miR-455可能靶向FABP4 mRNA的3′-UTR。

2.5 沉默F(xiàn)ABP4的HESC與空白對照的HESC存活率、凋亡率比較 見圖5。

圖5 沉默脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（HESC）與空白對照的HESC存活率、凋亡率比較

由圖5可見，20 μmol/L濃度過氧化氫溶液處理后，與空白對照的HESC比較，沉默F(xiàn)ABP4的HESC存活率上升、凋亡率下降（均P＜0.05）。

2.6 FABP4、miR-455聯(lián)合過表達(dá)的HESC與過表達(dá)miR-455的HESC存活率、凋亡率比較 見圖6。

圖6 沉默脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、miR-455聯(lián)合過表達(dá)的人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（HESC）與過表達(dá)miR-455的HESC存活率、凋亡率比較

由圖6可見，20 μmol/L濃度過氧化氫溶液處理后，與過表達(dá)miR-455的HESC比較，F(xiàn)ABP4、miR-455聯(lián)合過表達(dá)的HESC存活率下降、凋亡率上升（均P＜0.05）。

3 討論

本研究探討了miR-455對HESC氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果顯示，HESC miR-455表達(dá)水平隨過氧化氫溶液濃度升高呈劑量依賴性降低。miR-455異位表達(dá)減弱了過氧化氫誘導(dǎo)的HESC細(xì)胞破壞作用。進(jìn)一步，F(xiàn)ABP4被證實(shí)是miR-455的靶基因。由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致了腹膜腔中廣泛的炎癥反應(yīng)，在子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，本研究結(jié)果表明miR-455或可用于優(yōu)化子宮內(nèi)膜異位癥的臨床治療。

過氧化氫在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜粡V泛用作氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)物。過氧化氫進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的羥自由基，其與脂類、蛋白質(zhì)、DNA等大分子物質(zhì)相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[15]。CCK-8檢測和流式細(xì)胞分析被廣泛用于評估化學(xué)品對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，這兩項(xiàng)檢測技術(shù)在本研究中被用于評估過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，過氧化氫以劑量依賴性的方式降低了HESC的存活率，而增加了其凋亡。與此同時，過氧化氫也以劑量依賴性的方式降低了細(xì)胞內(nèi)miR-455的表達(dá)水平。盡管目前沒有研究報道m(xù)iR-455對HESC氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，Xu等[11]的研究顯示miR-455通過靶向cullin3激活Nrf2信號通路，從而對過氧化氫誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。Zhang等[10]研究也表明miR-455通過激活Nrf2/ARE通路對成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步明確了miR-455過表達(dá)顯著減輕了HESC的氧化應(yīng)激，同時也顯示，過氧化氫通過下調(diào)miR-455表達(dá)的方式抑制HESC增殖。

多項(xiàng)研究顯示過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在體外條件下誘發(fā)細(xì)胞凋亡[16-17]。本研究結(jié)果與前人結(jié)果類似，顯示相對低濃度的過氧化氫就能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中，miR-455的異位表達(dá)顯著抑制了過氧化氫誘導(dǎo)的HESC凋亡。因此，本研究得出結(jié)論，miR-455減弱了氧化應(yīng)激，從而對過氧化氫誘發(fā)的HESC損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

FABP4在本研究中被證明是miR-455的直接靶點(diǎn)。FABP1是FABP家族中的另一成員，已有研究表明FABP1通過其甲硫氨酸和半胱氨酸中和自由基[18]。然而，F(xiàn)ABP4在調(diào)控氧化應(yīng)激中的作用仍存在爭議。許多研究顯示抑制FABP4能夠在多種模型中抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[19-20]。本研究表明，下調(diào)FABP4表達(dá)產(chǎn)生了與miR-455類似的抗氧化效應(yīng)，而FABP4過表達(dá)則消除了這一效應(yīng)。因此，本研究提示靶向FABP4可能是抑制氧化應(yīng)激、治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效方法。

綜上所述，本研究結(jié)果提示了miR-455抑制HESC氧化應(yīng)激新的可能機(jī)制，F(xiàn)ABP4是miR-455的直接靶基因。miR-455或可作為治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效靶點(diǎn)。