淀粉、脂肪、蛋白質和NaCl成分對氣態ClO2殺菌效果的影響

畢秋蕓

(淄博職業學院制藥與生物工程系，山東 淄博 255314)

二氧化氯(ClO2)是一種具有獨特氣味的黃綠色氣體[1]。它極易溶于水并以非水解形式形成水溶液[2]。ClO2是一種應用范圍較廣的殺菌劑，作為一種高選擇性氧化劑，由于其獨特的單電子機制，能攻擊有機分子中富含電子的中心，并被還原為亞氯酸根離子[3]，其殺菌原理主要是對微生物細胞表面膜蛋白(包括參與運輸的酶)進行氧化攻擊[4]。ClO2能氧化酶中的巰基(—SH)和二硫化物(—S—S—)，使其生理功能失效。Young等[5]研究發現，細胞膜的損傷會使枯草芽孢桿菌的孢子失活，雖然受ClO2氧化損傷的孢子可以萌發，但不能繼續生長發育。ClO2主要以分子形式存在，很容易穿透細菌細胞膜，從而改變跨膜離子梯度并抑制呼吸，同時ClO2也會破壞微生物中的蛋白質合成[6]。

氣態ClO2和ClO2溶液作為消毒劑在食品殺菌領域應用非常廣泛[7]。作為一種消毒劑，氣態ClO2比ClO2溶液具備更多的優勢，具體表現在其高氧化能力，與有機物的反應性低，在低濃度和pH 3.0～8.0的范圍內殺菌效率很高，并且不會與氨、腐殖酸或其他有機前體反應形成有害的氯胺、氯酚和三鹵甲烷[8]。ClO2氣體還具有很強的滲透性和強溶解性，使其能夠盡可能地降低食品或與食品接觸面的微生物含量[9]。濃度、接觸時間、相對濕度以及溫度是影響氣態ClO2殺菌效果的主要因素[10]。ClO2的主要缺點是由它的不穩定性而形成的無機副產物，如亞氯酸鹽和氯酸鹽[11]。

研究擬先確定各種食源性病原體和腐敗微生物對氣態ClO2的敏感性。由于腌制肉類及黃瓜、胡蘿卜等加工過的蔬菜變質與腸膜明串珠菌有關，因此以腸膜明串珠菌為測試對象，探究食品中脂肪、蛋白質、碳水化合物以及氯化鈉等成分，對氣態ClO2殺菌效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食源性微生物革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌孢子、細菌芽孢、酵母菌：中國藥品生物制品檢驗所；

NaOH、HCl、KI、硫代硫酸鈉：分析純，成都西亞化工股份有限公司；

紫外/可見光光度計：Alpha-1900SPlus型，上海譜元儀器有限公司；

離心機：5930型，久保田商事株式會社；

顯微鏡：SteREO Discovery.V20型，德國卡爾蔡司公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株、孢子懸浮液的培養和制備 將細菌和酵母接種到5 mL無菌培養液中培養48 h，取一環培養物轉移到5 mL的肉湯中培養24 h，然后將培養物保存在7 ℃的瓊脂斜面上。霉菌在7 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上保存。分生孢子懸浮液通過將一些產孢菌絲體無菌轉移到Eppendorf試管中而制成的，試管中分別填充有1 g/L細菌蛋白胨和8.5 g/L NaCl的無菌溶液，然后將0.1 mL分生孢子懸浮液分散在PDA平板上。通過Marquenie等[12]的方法從培養皿中獲得孢子。用5 mL無菌0.3 g/100 mL吐溫-20溶液洗滌每個平板，并用無菌玻璃棉過濾孢子懸浮液兩次，去除菌絲碎片，然后，濾液在3 700×g下離心15 min。將沉淀的孢子重新懸浮于4 mL pH 7.2的無菌磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L)中。

為了制備蠟狀芽孢桿菌孢子的懸浮液，按照Gaillard等[13]的方法制備產孢培養基。分別將1 mL濃度40 mg/L MnSO4滅菌溶液和濃度100 mg/L CaCl2滅菌溶液添加到1 L的營養瓊脂中，然后，倒入培養皿，接種100 μL 經24 h培養的蠟樣芽胞桿菌。溫育4 d后，用無菌拭子刮平培養皿，用10 mL蛋白胨/NaCl溶液搖勻。將孢子懸浮液加熱至80 ℃保持10 min以破壞營養細胞。最后通過顯微鏡檢查孢子懸浮液的萌發孢子。

1.2.2 氣態ClO2處理 圖1為ClO2氣體處理系統示意圖，處理系統包括汽提塔、處理室和取樣裝置(圖1C)。汽提塔通過塑料管與處理室相連，處理室包含12個培養皿。通過溫濕度計測量室內的溫度和相對濕度。在左側與采樣設備建立了連接。穿孔管保證了室內ClO2氣體的分布。將用于處理的培養皿放置在入口管上方的穿孔塑料板上(圖1A和B)。柜蓋中央的風扇保證了ClO2的快速均勻分布。

圖1 ClO2氣體處理系統示意圖Figure 1 Diagram of the ClO2 gas treatment system

12個培養皿可以同時處理。每次處理前，通過4 L/h的熱濕空氣流將處理室內的相對濕度調節至90%以上，溫度控制為(25±3) ℃。通過水浴法將0.01%的ClO2溶液加熱至48 ℃，并通過壓縮空氣將ClO2從溶液中分離出來。每0.5 min對試驗箱中的空氣采用空氣取樣泵進行取樣，以1 L/min的速率從試驗箱中取出樣品。在處理室和取樣泵之間連續放置兩個含有25 mL 7 g/100 mL KI緩沖溶液(pH 7.0)的洗滌瓶，使得含有ClO2的空氣被吸入碘化鉀溶液。定量轉移兩個洗滌瓶的樣品并添加3 mL HCl (6 mol/L)溶液，用0.002 mol/L 硫代硫酸鈉滴定混合物至無色終點，以1 g/100 mL可溶性淀粉為指示劑。

?黃亞平:《“新型城鎮化”概念內涵、目標內容、規劃策略及認知誤區解析》，《城市規劃學刊》2013年第2期。

處理結束后，打開蓋子，取出培養皿。在初步試驗后選擇ClO2氣體濃度和處理時間，以確定閾值并進行量化分析。

1.2.3 微生物對氣態ClO2的敏感性 分別在瓊脂平板上接種100 μL的細菌、酵母菌、霉菌孢子懸浮液。在室溫下放置30 min后，于1 min(0.5 min供氣+0.5 min取樣時間)內用ClO2處理6個接種板。3個未經處理的瓊脂平板作為對照。

1.2.4 不同食物成分對ClO2殺菌效果的影響 腸膜明串珠菌的原代培養物在7 ℃的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面上保存，將接種物轉移到5 mL MRS肉湯培養基，并于30 ℃ 下孵育24 h。

為了研究可溶性多糖的影響，在MRS瓊脂中加入濃度為0，1，10，30 g/100 mL的可溶性淀粉。同樣，用濃度為0，1，3，5 g/100 mL NaCl制備平板培養基。用玉米油和未加鹽的黃油研究油脂存在的影響。玉米油、熔融態黃油和MRS瓊脂在121 ℃下分別蒸壓15 min。冷卻到48 ℃后，將玉米油和黃油添加到瓊脂中，以獲得最終的油脂濃度為1，10，30 mL/100 mL。隨后，添加Tween-20以穩定這些乳劑，使其最終濃度達到0.005 mL/100 mL。為了研究蛋白質存在的影響，采用pH為5.0～5.2的等電點乳清蛋白、含85%β-乳球蛋白和15%α-乳清蛋白(濃度分別為0，1，7 g/100 mL)進行研究。當乳清蛋白分離物濃度較高時，MRS瓊脂不能正常固化，將乳清分離蛋白粉末以干粉形式分別蒸壓(15 min，121 ℃)。將經過調質的MRS瓊脂添加到蛋白質粉末中，以獲得所需的蛋白質濃度。

1.2.5 微生物分析 將每個培養皿中的瓊脂轉移到無菌袋中，進行稀釋并將稀釋液涂在瓊脂培養基上，用MRS瓊脂平板進行食品成分試驗。在30 ℃下孵育2 d后記錄菌落總數。

1.2.6 ClO2處理對乳液過氧化物值的影響 以濃度為0.005 mL/100 mL 的吐溫-20為乳化劑，制備濃度為0%，1%，10%或30%玉米油乳液，并以0.005%吐溫-20溶液為對照。用Gray[14]的方法測定各乳液處理前后的過氧化值。將5 mL 各種樣品乳液溶解在10 mL氯仿/乙酸混合液中(體積比為2∶3)。然后，加入3 mL 14 g/100 mL 的KI溶液，將混合物置于黑暗中1 min。加入20 mL 1 g/100 mL的淀粉溶液作為指示劑后，用0.01 mol/L 硫代硫酸鈉溶液滴定混合物至無色終點，得到樣品中的過氧化值。

1.2.7 ClO2處理對乳清蛋白分離物中羰基含量以及—SH 和—S—S—基團的影響 將1%和7 g/100 mL乳清蛋白分離液處理為乳狀液，并于5 000×g離心8 min。分別經ClO2(1.38 mg/L)處理10 min以及ClO2(0.08 mg/L)處理1 min后，測定溶液中羰基含量。1%乳清蛋白分離液經ClO2(1.38 mg/L)處理10 min后，檢測其—SH和—S—S—的含量。

1.2.8 統計分析 用SPlus 7.0軟件進行所有的統計分析工作。由于數據的非正態性，使用非參數Krus-kal-Wallis檢驗分析經ClO2處理后獲得的微生物減少量。使用Mann-Whitney檢驗比較兩組試驗之間的平均微生物減少量。這兩種分析方法目的均是為了研究食物成分對ClO2殺菌效果的影響，以及ClO2處理對過氧化物值和羰基的影響。為了確定處理前后—SH和—S—S—含量差異的顯著性，采用假設方差相等和不相等的t檢驗。

2 結果與分析

2.1 常見食物微生物對氣態ClO2的敏感性

表1顯示了在室溫和相對濕度(90.0±0.5)%環境下，用(0.08±0.02) mg/L ClO2對微生物處理1 min后，各類微生物的平均減少量情況。除熒光假單胞菌受ClO2的影響較小，其他革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的平均下降量分別為3.5，2.6 lg (CFU/cm2)。酵母菌的平均下降量為1.1 lg (CFU/cm2)，而蠟樣芽孢桿菌和霉菌孢子的平均下降量很小。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的平均下降量差異顯著。除熒光假單胞菌和革蘭氏陽性菌外，酵母菌對ClO2抗性顯著高于革蘭氏陰性菌類的其他細菌，但低于霉菌孢子和蠟樣芽胞桿菌。

一般來說，革蘭氏陰性菌對ClO2的抗性優于革蘭氏陽性菌，而酵母菌表現出中等抗性，霉菌孢子和蠟樣芽孢桿菌是最具抗性的微生物。然而，熒光假單胞菌卻表現出非常優異的抗性，表明用ClO2處理熒光假單胞菌引起的腐敗是很困難的。此外，雖然盡可能的控制ClO2處理微生物的過程，但大多數的微生物對數減少率的基本偏差在0.5以上。基本偏差可能是由于工藝參數的變化影響，如ClO2汽提程度、相對濕度、溫度和室內氣體的分布。

表1 ClO2處理過的微生物平均減少量

目前關于氣態ClO2對食源性微生物殺菌作用的影響相關研究很少。據Han等[16]的研究報道，相比于乳酸菌，氣態ClO2更容易滅活酵母菌和霉菌的混合物。Reina等[17]研究了ClO2溶液對各種腐敗微生物的影響，根據其研究，ClO2溶液對酵母菌和霉菌的滅菌效果更為理想。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌對ClO2氣體抗性的不同，可能是由于革蘭氏陰性菌具有易于被ClO2穿透的板網肽聚糖細胞壁結構，而革蘭氏陽性菌細胞壁是三維網狀結構。

2.2 食物成分對氣態ClO2殺菌效果的影響

圖2顯示了在室溫和相對濕度(90.0±0.5)%的環境氛圍下，不同濃度的可溶性淀粉、氯化鈉、乳清蛋白分離物、玉米油及黃油對氣態ClO2[濃度(0.08±0.02) mg]處理腸膜明串珠菌的影響。

由圖2(a)可知，可溶性淀粉的存在對ClO2的殺菌效果沒有顯著影響。然而，添加相同濃度淀粉的瓊脂培養基在試驗1和試驗2之間，微生物減少量變化約為1 lg (CFU/cm2)。由圖2(b)可知，試驗1中，含有不同濃度NaCl的瓊脂培養基經ClO2處理后的微生物減少量差異不大。而在試驗2中，未添加NaCl的瓊脂培養基和添加5% NaCl的瓊脂培養基菌落數相差約2 lg (CFU/cm2)。由圖2(c)可知，乳清蛋白對ClO2的殺菌效果影響顯著。1%濃度的乳清蛋白使ClO2的抑菌效果顯著降低，而用7%的乳清蛋白和1%的乳清蛋白對二氧化氯的抑菌效果影響差不多。由圖2(d)和(e)可知，相對較低的玉米油或黃油濃度(1%)顯著降低了ClO2的殺菌效果。將黃油濃度從1%提高到10%對ClO2的抑菌效果沒有顯著影響，而30%則顯著降低了ClO2的抑菌效果。

雖然，在MRS瓊脂中添加淀粉或NaCl對ClO2的殺菌效果影響不大。但低濃度的油脂或蛋白質明顯降低了ClO2的殺菌作用。

目前還沒有關于食品成分對ClO2殺菌效果影響的研究報道，但食品成分對臭氧殺菌效果的影響已經得到了證實。與試驗結果相似，富含蛋白質的食物基質如牛血清白蛋白、酪蛋白酸鹽、牛奶或肉湯降低了臭氧的殺菌作用[18]，鮮奶油也會降低臭氧的殺菌作用[19]。蛋白質和脂質也降低了脈沖強光的殺菌作用。碳水化合物則根據微生物的不同而對殺菌的影響也不同[20]。

2.3 ClO2對油脂過氧化值和和乳清蛋白中羰基含量及—SH、—S—S—基團濃度的影響

在室溫及相對濕度為(90.0±0.5)%環境氛圍用ClO2處理1 min后，ClO2對玉米油乳劑過氧化值和乳清蛋白中羰基和—SH和—S—S—基團的影響如表2所示。從表2可以看出，用0.08 mg/L ClO2處理玉米油乳液1 min 后，所有乳劑的過氧化值都顯著增加。在0.08 mg/L ClO2處理下，1%和7%乳清蛋白溶液的羰基含量沒有顯著增加，但1.38 mg/L ClO2處理后，羰基含量顯著增加，1%乳清蛋白溶液的羰基含量增加了6倍以上，而7%乳清蛋白溶液中羰基含量的上升不太明顯，但仍達到145%。使用1.38 mg/L ClO2處理10 min后，1%乳清蛋白溶液中的—SH基團顯著降低，而總巰基量沒有顯著降低。研究結果表明，用1.38 mg/L ClO2處理后能夠誘導—SH到—S—S—的半轉化。

U. 接種但未經ClO2處理的參考樣品 T. 經氣態ClO2處理的接種樣品圖2 食物成分對氣態ClO2殺菌效果的影響Figure 2 Effects of food components on the antimicrobial activity of gaseous ClO2

表2 ClO2對玉米油乳劑過氧化值和和乳清蛋白中羰基含量及—SH、—S—S—基團濃度的影響?

ClO2的殺菌性能受蛋白質和脂肪的影響很大。原因是ClO2的強氧化特性及能與許多有機化合物進行反應。油脂存在時抗微生物效果降低可能是由于油脂中抗氧化劑(如油中的生育酚)和ClO2發生反應所致[21]。3種不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞油酸)約占玉米油脂肪酸含量的85%，而黃油主要含有飽和脂肪酸。鑒于ClO2氧化脂肪酸的程度與油脂中的雙鍵數量密切相關，而1%的脂肪已經提供了足夠的反應性位點，以消除0.08 mg/L ClO2處理的殺菌作用[22]。因此1%的黃油和1%的玉米油對ClO2殺菌效果的影響程度十分相似。這一點已被油—水乳劑的過氧化值的顯著增加所證實。

乳清蛋白顯著降低了ClO2的殺菌作用。ClO2會與酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸以及含硫氨基酸半胱氨酸和三肽谷胱甘肽發生反應，從而消耗了可用作消毒劑的ClO2的量[23]。乳清蛋白分離物含有質量分數約5%的含硫氨基酸。經過ClO2處理后，由ClO2誘導的蛋白質構象變化會促使芳香族氨基酸暴露，并可能導致還原的巰基(SH)基團增加暴露[24]。這項研究證實了ClO2增加了羰基含量并將—SH基團轉變為—S—S—基團，然而，濃度為1.38 mg/L的ClO2可顯著提高羰基含量和降低—SH 含量，而較低濃度的ClO2則有明顯的滅活作用。

3 結論

淀粉、NaCl對氣態ClO2的殺菌效果影響不大，而油脂和蛋白質則顯著降低了ClO2的殺菌作用。因此，在處理富含蛋白質和/或脂類的食品(如肉和魚制品)時，與富含碳水化合物的食品(如面包房產品、蔬菜和水果)相比，氣態ClO2的殺菌效果較差。由于細菌芽孢、酵母菌、霉菌和假單胞菌是富含蛋白質和/或脂類的食品腐敗的重要原因，因此需要較長的接觸時間和/或高濃度的ClO2來滅活這些更具抗性的微生物。