固相萃取—高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中萬古霉素類抗生素殘留量

林 津 范小龍 江 豐彭青枝 周陶鴻

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

萬古霉素類抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的糖肽類抗生素，其中典型的代表物有萬古霉素和去甲萬古霉素[1]。該類抗生素通過抑制肽聚糖的生物合成，可對革蘭氏陽性菌起到強力的滅殺作用，由于其藥效顯著，常常使用于其他抗生素對病菌無效時，即所謂的臨床“最后一線”抗生素[2]。雖然中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單中萬古霉素赫然在列，但由于獸藥生產(chǎn)經(jīng)營秩序不夠規(guī)范，獸藥濫用現(xiàn)象仍然較為嚴(yán)重，不法企業(yè)或養(yǎng)殖戶可能將其用于動物養(yǎng)殖，減少動物疫病的發(fā)生，以擴大養(yǎng)殖利潤[3-4]?？煽康臍埩魴z測方法是進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品抽檢和市場監(jiān)管的基礎(chǔ)和前提。因此，建立動物源食品中萬古霉素類抗生素殘留量檢測方法，加強相關(guān)食品的監(jiān)控是非常必要的。

目前現(xiàn)行有效的針對萬古霉素類抗生素的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)只有農(nóng)業(yè)部1862號公告-3-2012《飼料中萬古霉素的測定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》和吉林地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T 1825—2013《豬肉中萬古霉素殘留量的測定 液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，標(biāo)準(zhǔn)適用性較窄，難以廣泛應(yīng)用，不利于中國動物性食品安全監(jiān)管。而關(guān)于萬古霉素類化合物的分析方法已見報道的有：液相色譜法、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法、酶放大免疫法、毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光法、熒光偏振免疫法、近紅外光譜法、微生物法[5-7]等，分析對象主要是集中在人體樣本如血清、血漿和尿液[8-10]等。而針對動物源食品的分析研究并不多，且基質(zhì)較單一，基本只有單獨檢測豬肉、牛乳和魚蝦等一種基質(zhì)，且目標(biāo)物主要集中在萬古霉素這一種物質(zhì)上，導(dǎo)致此類抗生素檢測覆蓋不全，不利于檢測資源的優(yōu)化配置和監(jiān)管效能的提高[1-5]。所以對于脂肪含量較高、基質(zhì)成分復(fù)雜的動物源食品中萬古霉素類抗生素同時測定的研究還較少，且提供的方法在實際操作過程中相對復(fù)雜、穩(wěn)定性差[6-7]。研究擬采用固相萃取凈化—高效液相—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，對日常食用的動物源性食品基質(zhì)中萬古霉素類抗生素的殘留進(jìn)行檢測，以期為獸藥殘留監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、雞肉、鴨肉、豬肝：武漢市售；

萬古霉素和去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度均>98%；美國MCE公司；

雙去氯萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度>75%；加拿大Toronto公司；

乙腈、甲酸、甲醇：色譜純，德國Merck公司；

氨水、鹽酸、正己烷：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

OasisMCX固相萃取柱：美國Waters公司；

試驗用水：一級水，美國Mill-pore-Q超純水儀制得。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國Thermo公司；

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：AB sciex 4500型，美國Applied Biosystems公司；

電子天平：ME2002E型和XS204型，瑞士Mettler-Toledo公司；

超聲清洗器：Elmasonic P60H型，德國Elma公司；

臺式冷凍離心機：Allegra X-15R型，美國Beckman公司；

水浴氮吹儀：N-EVAP24型，美國Organomation公司；

數(shù)顯漩渦混合器：EOFO-9456型，美國Taloys公司。

風(fēng)電機組的聯(lián)軸器是整機中故障率比較高的部件，而且聯(lián)軸器發(fā)生失效后，對機組的安全、穩(wěn)定運行有很大的影響。失效型式和預(yù)防措施，可為其他風(fēng)電機組聯(lián)軸器的設(shè)計、測試驗證及降低失效率提供了參考。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取25 mg萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品和去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，于不同的25 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解，再定容至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確稱取雙去氯萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.000 1 g)，于10 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解，再定容至刻度線，搖勻，配制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。以上儲備液均置于4 ℃保存，有效期1個月。

用0.1%甲酸水溶液稀釋，配制成濃度為1 μg/mL的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液以及1 μg/mL的雙去氯萬古霉素內(nèi)標(biāo)中間液，4 ℃條件下可保存1個月。臨用前，分別準(zhǔn)確移取適量的1 μg/mL的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標(biāo)準(zhǔn)中間液以及雙去氯萬古霉素內(nèi)標(biāo)中間液，用0.1%甲酸水溶液進(jìn)行稀釋，制成內(nèi)標(biāo)濃度為100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液(20～200 μg/L)。

1.4 樣品預(yù)處理

1.4.1 樣品提取 稱取5.00 g經(jīng)組織搗碎機絞碎并充分均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入100 μL濃度為1 μg/mL 的雙去氯萬古霉素內(nèi)標(biāo)中間液，加入10 mL 0.1% 甲酸—乙腈提取液(體積比70∶30)，加蓋渦旋混勻1 min，并超聲提取15 min。然后在4 ℃、9 500 r/min離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中。殘渣用10 mL 上述提取液重復(fù)提取一次，合并兩次上清，加入5 mL 乙腈飽和正己烷，渦旋混勻1 min，4 ℃、9 500 r/min 離心10 min，取下層清液，待凈化。

1.4.2 樣品凈化 Oasis MCX固相萃取柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液活化，保持柱體濕潤。取全部待凈化液加入活化后的固相萃取柱，上樣后依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，3 mL甲醇淋洗，棄去全部淋洗液。最后用6 mL流速穩(wěn)定1 mL/min 內(nèi)的5%氨水—甲醇溶液洗脫，并收集洗脫液，置于40 ℃水浴氮氣吹干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液—乙腈溶液(體積比90∶10)復(fù)溶，過微孔濾膜(0.22 μm)后，上HPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜條件

色譜柱選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，規(guī)格型號為2.1 mm×100 mm，2.2 μm；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；HPLC梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC梯度洗脫程序

1.6 質(zhì)譜條件

離子源類型：ESI源；掃描方式：MRM正離子模式掃描；離子源溫度(TEM)：550 ℃；霧化氣(Gas1)：34 MPa；輔助氣(Gas2)：38 MPa；氣簾氣(Gurtain Gas)：25 MPa；電噴霧電壓：4 500 V；通過儀器優(yōu)化后的萬古霉素、去甲萬古霉素及雙去氯萬古霉素的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)?

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確立

萬古霉素、去甲萬古霉素和雙去氯萬古霉素的電噴霧離子化效果較好，故采用電噴霧離子化源進(jìn)行分析。根據(jù)物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，通常選擇豐度最高的離子對為母離子[11]，同時在正負(fù)模式下對比母離子響應(yīng)強度，最終選擇在正離子模式下進(jìn)行分析。將高濃度的目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)溶液在正離子模式下通過一級掃描找到母離子，對選定的母離子加優(yōu)化好的碰撞能擊碎，同時進(jìn)行二級掃描找到對應(yīng)的碎片離子[12]。萬古霉素類抗生素是由多個氨基酸和糖縮合而成的糖肽類大分子化合物，進(jìn)入質(zhì)譜后很容易與H+結(jié)合，產(chǎn)生雙電荷或三電荷離子[13]。經(jīng)試驗?zāi)繕?biāo)物和內(nèi)標(biāo)均選擇豐度最大的雙電荷m/z725.4，718.4，690.9作為母離子，定性離子取干擾較小、豐度較高的兩個質(zhì)荷比分別為144.1和100.1碎片離子[14]，且豐度最高m/z144.1作為定量離子。在選擇好的特征碎片離子的基礎(chǔ)上，對產(chǎn)生碎片離子的碰撞能量、錐孔電壓等其他質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化來提高分析方法的靈敏度，進(jìn)一步優(yōu)化后最終確立的質(zhì)譜重要參數(shù)及相應(yīng)的質(zhì)譜條件見1.6。

2.2 色譜條件的確立

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取試劑的選擇 在陰性豬肉基質(zhì)中添加了100 μg/kg 目標(biāo)物，考察了0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸—乙腈體積比分別為90∶10，80∶20，70∶30，60∶40的溶液提取效果。單純用0.1%甲酸溶液提取動物源樣品時，由于基質(zhì)中的蛋白沒有得到有效沉淀，提取液較渾濁，必須提高乙腈比例沉淀蛋白。隨著乙腈相比例的提高，提取液逐漸澄清，但乙腈相比例超過30%時回收率無法進(jìn)一步提升，且基質(zhì)效應(yīng)明顯，結(jié)果如圖2所示，最終選擇0.1%甲酸—乙腈(體積比70∶30)溶液作為提取液。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化 動物源食品中難免有較多的脂類雜質(zhì)，經(jīng)0.1%甲酸—乙腈(體積比70∶30)溶液提取后，仍不足以去除脂類雜質(zhì)的干擾，于是增加了正己烷除脂步驟。由于目標(biāo)物微溶于乙腈，而乙腈與正己烷還存在少量互溶，若要避免萬古霉素類抗生素在萃取時的損失，使用乙腈飽和的正己烷除脂效果更好[17]。加入5 mL的乙腈飽和正己烷，渦旋混勻1 min，可以看到正己烷層明顯有油脂析出，說明除脂效好。

圖1 添加目標(biāo)物樣本的選擇離子流色譜圖Figure 1 Selected ion chromatogram of samples for adding objects

圖2 不同配比的0.1%甲酸水溶液—乙腈提取液效果比較Figure 2 Extraction efficiency with different solutions

試驗檢測對象為動物源樣品，基質(zhì)較復(fù)雜，若直接提取后上機，不進(jìn)行進(jìn)一步的凈化處理，提取液中一并提取的其他雜質(zhì)必定會對檢測帶來干擾和影響，從而影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此必需要增加凈化處理步驟[18]。由于含有堿性的伯氨基團，目標(biāo)物偏弱堿性[5]，將市面上主流廠家的固相萃取柱，如Waters、Agela、Thermo、Agilent的陽離子交換柱MCX柱、C18柱和HLB柱等進(jìn)行對比。配制濃度為60 μg/L的目標(biāo)物混合標(biāo)液，采用標(biāo)準(zhǔn)溶液直接過固相萃取柱凈化的方式考察不同固相萃取柱的影響。結(jié)果表明，陽離子交換柱(3 mL)凈化，目標(biāo)物回收率為90%～95%；HLB柱(3 mL)凈化，萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率為50%～70%；用C18柱(3 mL)凈化時，萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率為30%～40%?；诨厥章实膶Ρ惹闆r，故用陽離子交換柱MCX柱來凈化萬古霉素、去甲萬古霉素。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，是通過陰性基質(zhì)匹配標(biāo)線與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)曲二者的斜率之比來進(jìn)行評價的[11]。分別配制濃度范圍為20～200 μg/L的陰性基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，計算兩者斜率比值。針對動物源食品基質(zhì)，萬古霉素和去甲萬古霉素的ME均在70%左右，說明存在一定程度的離子抑制效應(yīng)。為消除基質(zhì)效應(yīng)使定量更加精準(zhǔn)，既可采取基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線校正法，也能采用內(nèi)標(biāo)法定量。選擇內(nèi)標(biāo)物時，不僅要求內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物的物理化學(xué)性質(zhì)相似，同時不與被測定樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且應(yīng)與目標(biāo)物的出峰時間相近等[19]。試驗選用的內(nèi)標(biāo)物——雙去氯萬古霉素的結(jié)構(gòu)只比萬古霉素分子結(jié)構(gòu)的少2個氯，所以其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與萬古霉素基本無差異，可以滿足內(nèi)標(biāo)物的要求[20]。目前使用該內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行萬古霉素和去甲萬古霉素檢測的研究較少，主要分布在魚蝦基質(zhì)中。

2.5 線性范圍、檢出限(LOD)與定量限(LOQ)

配制濃度依次為20，40，80，120，160，200 μg/L的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述優(yōu)化后的液相條件、質(zhì)譜參數(shù)及最終確立的分析方法下進(jìn)行測定。以目標(biāo)物的濃度(μg/L)為x，萬古霉素或去甲萬古霉素與內(nèi)標(biāo)雙去氯萬古霉素的峰面積比值為y，進(jìn)行線性曲線擬合。如表2所示，在20～200 μg/L的線性范圍內(nèi)，目標(biāo)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均可達(dá)到0.997以上。將陰性基質(zhì)加標(biāo)樣按優(yōu)化后的前處理方法進(jìn)行處理，同時按最終確立的分析方法進(jìn)行檢測，以目標(biāo)物信號噪聲比值(S/N)為3時的加標(biāo)水平作為LOD，以S/N為10時的加標(biāo)水平作為LOQ，方法檢出限可低至1.0 μg/kg，定量限可達(dá)到3.0 μg/kg。

表3 目標(biāo)物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 方法的回收率與精密度

分別取豬肉、雞肉、鴨肉、豬肝4種基質(zhì)，基質(zhì)中均不含試驗方法所檢測的目標(biāo)物，按照20，50，200 μg/kg 3個濃度水平分別添加標(biāo)樣，每個水平做6個平行樣，按上述方法進(jìn)行分析，計算回收率和精密度，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 試驗方法的回收率與精密度

結(jié)果表明，目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率為88.7%～115.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.1%～9.4%(n=6)。按照GB/T 27404—2008標(biāo)準(zhǔn)，在被測組分含量小于0.1 mg/kg時回收率的要求為60%～120%，被測組分含量在0.1～1.0 mg/kg 時回收率的要求為80%～110%。因此，試驗方法回收率和精密度均滿足要求。

3 結(jié)論

試驗建立了一種動物源食品中萬古霉素類抗生素殘留量的高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析方法，通過選擇提取效率更高的提取液，除脂效果更好的萃取液，陽離子固相萃取柱凈化的一系列前處理步驟更進(jìn)一步的減少了雜質(zhì)干擾，且對比考察了更優(yōu)的色譜及質(zhì)譜條件，同時使用雙去氯萬古霉素作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析，有效提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，并進(jìn)一步降低了檢出限。在20～200 μg/kg添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為88.7%～115.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～9.4%(n=6)，方法檢出限低至1.0 μg/kg，定量限達(dá)到3.0 μg/kg。該方法回收率高，檢出限低，分析時間短，適用于批量的動物源食品中萬古霉素類抗生素殘留量的同時檢測。試驗建立的方法在已報道的豬肉制品、水產(chǎn)品等基質(zhì)基礎(chǔ)上又有了進(jìn)一步的擴充和驗證，同時又由于合適的內(nèi)標(biāo)的引入比基質(zhì)匹配的方法在基質(zhì)消除這一方面更簡便快捷，使得試驗方法基質(zhì)覆蓋更全、適用性更廣、實用性更強。以復(fù)雜基質(zhì)樣品為分析對象時，固相萃取—高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法的高分離性、高選擇性、高靈敏度以及能獲取目標(biāo)物結(jié)構(gòu)信息[7]等一系列優(yōu)點，能夠滿足痕量分析檢測的要求，將在動物源食品抗生素殘留量抽檢工作方面發(fā)揮越來越重要的作用。