新生豬缺氧缺血腦損傷后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建相關(guān)蛋白的表達

張志男，鄭陽，王曉明

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004）

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建是腦組織缺氧缺血 （hypoxicischemic，HI） 損傷后腦功能恢復(fù)過程中必須經(jīng)歷的過程，重建過程主要包括突觸和軸突的再生，主要評估指標(biāo)有突觸素 （synaptophysin，Syn） 和神經(jīng)蛋白聚糖 （neurocan，Neu） 等。Syn可以準(zhǔn)確反映突觸的密度和分布，參與突觸的形成和穩(wěn)定性的維持，可以作為反映神經(jīng)損傷后修復(fù)機制的標(biāo)志性分子［1］。Neu是由神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌的特異性蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞連接，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)修復(fù)過程，與膠質(zhì)瘢痕形成和抑制軸突生長等生理和病理過程密切相關(guān)［2］。本研究采用新生豬急性HI模型，模擬新生兒HI病理變化，檢測Syn和Neu的表達，分析HI后神經(jīng)再生信號途徑的交互作用及新生細胞與受損神經(jīng)細胞間的相互關(guān)系，進一步闡明HI損傷后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建機制，以加深對新生兒缺氧缺血性腦病的理解，為其診斷和治療提供有意義的幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

選用健康新生約克夏豬，3～5日齡，雌雄不限，共計28頭，平均體質(zhì)量約為1.0～1.5 kg，隨機為對照組 （n=4） 和HI模型組 （n=24）。HI模型組根據(jù)HI后的存活時間分為6個亞組，分別為0～2 h亞組、2～6 h亞組、6～12 h亞組、12～24 h亞組、24～48 h亞組、48～72 h亞組，每個亞組4頭。所有實驗動物執(zhí)行《實驗動物管理條例》和《實驗動物許可證管理辦法》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過我院倫理委員會審批。

1.2 動物模型的制作

1.2.1 對照組:在28～30 ℃的室溫條件下進行手術(shù)操作，以0.6 mL/kg劑量肌注麻醉藥 （速眠新注射液，長春軍事醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)研究所）。待新生豬麻醉失去意識后進行氣管插管 （直徑2.5 mm），同時連接到小動物呼吸機 （TKR.200C，江西特力麻醉呼吸設(shè)備中國有限公司） 進行機械通氣，通入100%氧氣 （我院醫(yī)療用品站配制）；使用Tuff Sat手掌式脈搏血氧儀（美國GE公司） 監(jiān)測心率和血氧飽和度。用碘伏消毒頸部皮膚，取頸部正中切口，將雙側(cè)頸總動脈與頸內(nèi)靜脈和喉返神經(jīng)小心游離開，不做其他操作，直接縫合切口。

1.2.2 HI模型組:模型組新生豬進行上述相同操作，游離雙側(cè)頸總動脈后，放置于保溫箱內(nèi)約30 min，待其狀態(tài)穩(wěn)定，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈阻斷血流，同時機械通入含氧濃度為6%的氮氧混合氣（大連大特氣體有限公司），計時，維持HI狀態(tài)40 min后恢復(fù)雙側(cè)頸總動脈血流，同時機械通氣改為通入100%氧氣。最后縫合切口，自主呼吸恢復(fù)后停用呼吸機。全程嚴密監(jiān)控血氧飽和度和心率，及時處理術(shù)中和術(shù)后可能發(fā)生的休克、抽搐等癥狀。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 染色過程:HI造模完成后，根據(jù)不同時間段分組處死動物，迅速取出腦組織，置于4%多聚甲醛中固定，以冠狀面為標(biāo)準(zhǔn)切成4 mm厚的組織片，保留含有基底節(jié)區(qū)的層面，經(jīng)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，切片厚4 μm，進行Syn和Neu免疫組化染色，采用鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法，DAB顯色。使用37 ℃烤箱烤干切片，然后進行常規(guī)脫水、透明、封片的操作。陰性對照用PBS代替一抗。Syn和Neu抗體由英國Abcam公司提供。

1.3.2 免疫組化染色圖像的采集與結(jié)果的判斷:由2位病理科醫(yī)師協(xié)助判定Syn和Neu的免疫組化染色結(jié)果，鏡下出現(xiàn)棕黃色斑塊或顆粒為陽性表達。免疫組化圖像的采集和處理應(yīng)用日本Nikon Edipse E 800顯微鏡和日本NIS-Elements F 2.30圖像采集軟件，400倍鏡下觀察。免疫組化圖像光密度 （optical density，OD） 值的分析應(yīng)用日本NIS-Elements BR 2.10圖像分析軟件，以O(shè)D值的大小表示Syn表達的多少。每張切片基底節(jié)區(qū)各觀察5個視野，綜合分析5個視野的數(shù)據(jù)，判斷對照組和HI模型組各亞組中Syn和Neu的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Syn的免疫組化染色結(jié)果和表達變化趨勢

HI后基底節(jié)區(qū)Syn的免疫組化染色結(jié)果 （圖1）顯示，各組均見大量棕黃色染色，HI模型組6～12 h亞組染色最多。Syn的OD值整體呈先升高后降低的趨勢，6～12 h表達達到高峰，而后下降。與對照組相比，HI模型組0～2 h亞組、2～6 h亞組、6～12 h亞組Syn的表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05）；與HI模型組6～12 h亞組相比，HI模型組12～24 h亞組、24～48 h亞組、48～72 h亞組Syn的表達均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 HI后72 h內(nèi)Syn的OD值變化趨勢Fig.2 The trend of OD value of Syn within 72 h after HI

2.2 Neu的免疫組化染色結(jié)果和表達變化趨勢

圖3 各組Neu的表達 ×400Fig.3 Expression of Neu in each group ×400

HI后基底節(jié)區(qū)Neu的免疫組化染色結(jié)果 （圖3）顯示，各組整體染色淺淡，僅可見少量棕黃色染色，6～12 h亞組染色最少，24～48 h亞組染色最多。Neu的OD值整體呈先降低后升高再降低的趨勢，6～12 h表達最低，而后升高，24～48 h表達達到高峰，隨后下降。與HI模型組6～12 h亞組相比，對照組及HI模型組0～2 h亞組、2～6 h亞組、12～24 h亞組、24～48 h亞組、48～72 h亞組Neu的表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05）；與HI模型組24～48 h亞組相比，對照組及HI模型組0～2 h亞組、2～6 h亞組、6～12 h亞組、12～24 h亞組、48～72 h亞組Neu的表達均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見圖4。

3 討論

圖4 HI后72 h內(nèi)Neu的OD值變化趨勢Fig.4 The trend of OD value of Neu within 72 h after HI

既往針對Syn和Neu的研究［3-5］多集中于嚙齒類動物如新生大鼠的海馬區(qū)，且多為HI損傷后較遠期的研究。本研究選擇新生豬為實驗對象，研究72 h內(nèi)急性期時較易受HI影響的基底節(jié)區(qū)Syn和Neu表達的變化規(guī)律，闡釋HI后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的機制，以及再灌注損傷對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的影響。

Syn是一種位于突觸前囊泡膜上的鈣結(jié)合蛋白，與突觸的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，是突觸連接的標(biāo)志。Syn參與突觸小泡膜與突觸前膜的融合，直接影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和囊泡的轉(zhuǎn)運，在突觸形成和重塑的過程中發(fā)揮重要作用［6］。由于Syn的含量與突觸的密度呈正相關(guān)，因此檢測Syn免疫陽性產(chǎn)物的OD值，就可以反映突觸前囊泡的分布，進而推測出突觸數(shù)量和密度的變化情況［7］。

本研究通過檢測HI后不同時間Syn的表達，描述Syn的動態(tài)變化，這種動態(tài)變化提示了HI后突觸的損傷和重建。本研究結(jié)果顯示，72 h內(nèi)的急性期Syn的變化整體呈先升高再降低的趨勢。對照組神經(jīng)元完好，鏡下可見均勻分布的Syn表達陽性產(chǎn)物。HI模型組Syn的表達12 h前呈升高趨勢，提示突觸發(fā)生了再生，推測發(fā)育期腦組織在HI狀態(tài)的同時即開始神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建過程，HI狀態(tài)解除后，未死亡的神經(jīng)細胞在得到血氧供應(yīng)后短時間內(nèi)即可代償性大量表達Syn，以便盡快恢復(fù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)腦組織由低灌注轉(zhuǎn)為再灌注時，會出現(xiàn)再灌注損傷，通常發(fā)生在HI后的6～24 h內(nèi)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，Syn的表達在6～12 h達高峰后隨時間延長整體呈下降趨勢，Syn減少提示突觸受到損傷，推測其與再灌注損傷的出現(xiàn)有關(guān)。此時再灌注損傷逐漸加重，一方面HI后乳酸大量堆積，腦組織優(yōu)先利用乳酸供能，但乳酸代謝產(chǎn)生的能量不足以維持神經(jīng)元正常的生理活動，能量不足加重了神經(jīng)損傷［9］；另一方面谷氨酸的穩(wěn)態(tài)失衡，引起興奮性毒性損傷，通過壞死、凋亡和自噬等機制導(dǎo)致細胞損傷或死亡［10］。據(jù)此，筆者認為HI后的再灌注損傷比HI狀態(tài)本身造成的直接損傷更加嚴重。

Neu是硫酸軟骨素蛋白聚糖的一種，主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是細胞外基質(zhì)的成分，參與膠質(zhì)瘢痕的形成，是一種軸突生長抑制蛋白［11］。MATSUI等［12］在成年鼠腦損傷模型中發(fā)現(xiàn)Neu在腦損傷后表達增高，認為腦損傷后Neu的聚集可能參與腦損傷后神經(jīng)的修復(fù)過程。生理情況下，Neu的主要作用為抑制軸突的無序生長，誘導(dǎo)神經(jīng)纖維向正確的靶細胞投射，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，Neu可有短暫性表達增加，抑制軸突生長［13］。

本研究通過檢測HI損傷后不同時間Neu的表達，探討神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建相關(guān)抑制因素在HI腦損傷后的變化規(guī)律。在HI后的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建過程中，軸突的再生受到Neu的調(diào)控。對照組可見Neu的表達，即未受損發(fā)育期腦組織有Neu的表達，這與既往的研究［14］一致。HI后Neu的表達逐漸下調(diào)，至12 h達最低，此時神經(jīng)元和軸突受損，由于Neu抑制軸突再生長的作用，此時Neu表達的下調(diào)有利于軸突的恢復(fù)；12 h后，軸突得到一定的恢復(fù)，Neu的表達增加，在一定程度上抑制神經(jīng)軸突的無序生長，消除錯誤分支，保證軸突生長方向的正確性，確保軸突可以與正確的靶細胞相連，此時再灌注的損傷加重以及Neu的抑制作用，軸突再次受損減少，因此48 h后Neu的表達再次下調(diào)。Neu雖有保證軸突正確生長的作用，但其影響軸突的再生，遲滯了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的過程。Syn和Neu在HI后的神經(jīng)再生過程中共同發(fā)揮作用，確保神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建過程得以正確進行。

神經(jīng)系統(tǒng)受到HI損傷后，突觸和軸突受到破壞，信息的傳遞、加工和儲存出現(xiàn)障礙，此時若不及時干預(yù)治療，可能導(dǎo)致嚴重的后遺癥，甚至死亡。在HI后6～24 h這段“治療時間窗”內(nèi)及時干預(yù)，可能減輕腦損傷程度甚至阻斷腦損傷進展［8］。因此，尋找Syn和Neu表達的干預(yù)因素成為治療缺氧缺血性腦病的研究方向。粒細胞集落刺激因子結(jié)合豐富環(huán)境的刺激等可以上調(diào)Syn的表達，促進突觸的再生［4］；移植骨髓間充質(zhì)干細胞等可以下調(diào)Neu的表達，間接促進軸突的再生［2］。這些研究為缺氧缺血性腦病早期促進神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建提供了可能的治療方法。

新生豬與新生大鼠相比有著更多的優(yōu)勢，但相關(guān)研究較少。新生豬與新生兒有更多的相似性，能夠更好的模擬新生兒HI損傷，更貼近新生兒HI損傷后的自然狀態(tài)［15］。本研究采用新生豬制作急性HI模型，該模型通過阻斷雙側(cè)頸總動脈來維持HI狀態(tài)，維持一定時間后再恢復(fù)血供，有利于模擬再灌注的研究［16］。本課題組前期研究［17］已經(jīng)證實該模型的重復(fù)性較高，實驗結(jié)果較為可靠，雖然該模型的制作可能和臨床病例實際情況有一定的差別，但仍不失為一種良好的動物模型。

發(fā)育期腦組織本來就存在大量的神經(jīng)發(fā)生，活體HI損傷后Synt和Neu的變化規(guī)律可能更加復(fù)雜，新生豬HI模型Syn和Neu的表達在72 h后及更遠期的變化規(guī)律仍需更進一步的研究。總之，研究Syn和Neu在HI損傷后不同時期的變化規(guī)律，對研究新生兒缺氧缺血性腦病神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的病理改變及其修復(fù)機制具有重要的意義，可為指導(dǎo)新生兒發(fā)生缺氧缺血性腦病后促進腦神經(jīng)修復(fù)的臨床治療提供實驗依據(jù)。