不同氨基聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

尹玉，韓碩，王國(guó)鋒，王琦，金元哲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110032）

透明質(zhì)酸 （hyaluronic acid，HA） 和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS） 是2種不同的氨基聚糖，且已證實(shí)均是可靠的細(xì)胞移植可降解生物支架材料［1］。巨噬細(xì)胞可極化為M1和M2型，研究［2］顯示巨噬細(xì)胞對(duì)組織的炎癥反應(yīng)起重要作用。M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)［3-4］，M2型巨噬細(xì)胞起抗炎作用［5-6］。白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor，TNF-α） 及誘導(dǎo)性一氧化氮合酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS） 為M1型巨噬細(xì)胞特征性細(xì)胞因子［3，7-9］；而精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1） 是M2型巨噬細(xì)胞特征性細(xì)胞因子［3，7，9-11］。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)IL-1β、TNF-α、iNOS、Arg-1mRNA表達(dá)，分析HA和CS對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，旨在選擇更好的支架材料，減少細(xì)胞移植的炎癥反應(yīng)和炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 HA及CS水凝膠支架材料制成

按照已知方法［1］合成CS-N羥基琥珀酰亞胺 （N hydroxysuccinimide，NHS）及HA-NHS。將HA/CS-NHS加入到磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS） 中制成10%混合液，再將混合液和胎牛血清 （體積比為1 ∶1） 制成HA/CS-血清水凝膠。其中CS-血清水凝膠制成中，先在胎牛血清中加入Bobine血清白蛋白（20 g/dL），然后再與CS混合以促進(jìn)CS-FBS 水凝膠凝固。

1.2 巨噬細(xì)胞提取及培養(yǎng)

1.2.1 骨髓源性巨噬細(xì)胞 （bone marrow derived macrophage，BMDM ）提取與分化［12-13］:6～8周齡小鼠分離出股骨和脛骨，用25G針頭和10 mL注射器吸取冷PBS液沖洗骨髓，并用70 μm細(xì)胞過(guò)濾器除去雜質(zhì) （骨質(zhì)、毛發(fā)和其他細(xì)胞組織）。在濾過(guò)的溶液中加入1×紅細(xì)胞裂解液 （10 mL），在37 ℃水浴中培養(yǎng)5 min除去血紅細(xì)胞，然后室溫條件下 500g離心5 min，在離心管底部獲得所需細(xì)胞，抽吸出上層清液，用BMDM生長(zhǎng)液輕輕溶開(kāi)離心管底部細(xì)胞團(tuán)，放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （24孔板，2×105/孔），每3 d更換新鮮BMDM生長(zhǎng)液［12-13］，7 d后獲得BMDM。選用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)BMDM以便于細(xì)胞分離和收集。將BMDM培養(yǎng)皿自培養(yǎng)箱中取出，放冰面0.5 h，然后輕輕敲彈皿底使細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，用移液管吸出［13］。

1.2.2 BMDM水凝膠植入與培養(yǎng):將BMDM細(xì)胞（8 000/μL） 混入胎牛血清中，再與10% CS/HA-NHS的PBS混合液 （體積比 1 ∶1） 混合制成HA/CS-血清水凝膠。在凝膠凝固過(guò)程中快速抽取凝膠液放入培養(yǎng)板中，凝膠凝固后 （30～60 s） 將IMDM培養(yǎng)液注入培養(yǎng)板內(nèi) （12孔培養(yǎng)板，細(xì)胞2×105/孔，水凝膠50 μL/孔）。HA和CS 2組均25個(gè)水凝膠標(biāo)本。

1.3 實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)

分別在細(xì)胞培養(yǎng)0、4、24、48、72 h各組收取5個(gè)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR分析 （美國(guó)Applied Biosystems QuantStudio公司）。使用高純度RNA提取試劑 （荷蘭Roche公司） 提取mRNA。使用 iScript cDNA合成試劑 （荷蘭Bio-Rad公司） 合成cDNA。將cDNA+引物+sensiMix SYBR Hi-ROX （比利時(shí)Bioline公司） 共同加入試管制成20 μL溶液。引物［3，7-11］包括M1極化基因IL-1β、TNF和iNOS和M2極化基因Arg-1，內(nèi)參為GAPDH。引物序列為:IL-1β，F(xiàn)，5’-GGCAACCGTACC TGAACCCA-3’；R，5’-CCACGATGACCGACACCAC C-3’。TNF，F(xiàn)，5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTC T-3’；R，5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’。iNOS，F(xiàn)，5’-CCGAAGCAAACATCACATTCA-3’；R，5’-GGTCTAAAGGCTCCGGGCT-3’。Arg-1，F(xiàn)，5’-TGTCCCTAATGACAGCTCCTT-3’；R，5’-GCATCCACCCAAATGACACAT -3’。GAPDH，F(xiàn)，5’-ATACGGCTACAGCAACAGGG-3’；R，5’-GCCTCTCTTGCTCAGTGTCC-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，與0 h比較，48 h HA水凝膠巨噬細(xì)胞中的TNFmRNA和iNOSmRNA增加 （P＜ 0.05）。與0 h比較，48 h CS水凝膠巨噬細(xì)胞中的Arg-1mRNA增加 （P＜ 0.05）。見(jiàn)表1、2。

3 討論

巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典激活的M1型和替代激活的M2型，它們對(duì)炎癥反應(yīng)的作用完全不同。M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，破壞細(xì)胞外基質(zhì)［3-4］，M2型巨噬細(xì)胞起抗炎作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重建，促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管再生［5-6］。研究已經(jīng)證實(shí)M1型巨噬細(xì)胞加重器官和機(jī)體損傷［3-4］，M2型巨噬細(xì)胞可以減少損傷［4，14］。

表1 實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)HA水凝膠中細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間IL-1β、TNF、iNOS、Arg-1 mRNA結(jié)果Tab.1 mRNA expression of IL-1β，TNF-α，iNOS，and Arg-1 in the context of an HA-based hydrogel at different time points by RT-qPCR

表2 實(shí)時(shí)qPCR檢測(cè)CS水凝膠中細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間IL-1β、TNF-α、iNOS、Arg-1 mRNA表達(dá)結(jié)果Tab.2 mRNA expression of IL-1β，TNF-α，iNOS，and Arg-1 in the context of a CS-based hydrogel at different time points by RT-qPCR

有研究［15-16］發(fā)現(xiàn)，M1誘導(dǎo)因子LPS/IFN-γ促進(jìn)HA與巨噬細(xì)胞結(jié)合；而M2誘導(dǎo)因子IL-4促使CS與巨噬細(xì)胞表面的CD44受體結(jié)合。因此，HA和CS很可能對(duì)巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)換起不同的作用，即HA使巨噬細(xì)胞極化為具有促炎作用的M1型，而CS使巨噬細(xì)胞極化為具有抗炎作用的M2型。本研究結(jié)果顯示，HA水凝膠中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA和iNOSmRNA增加，TNF-α為M1型巨噬細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，iNOS為M1型巨噬細(xì)胞的特異基因，因此表明HA培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞很可能向M1型極化；而CS水凝膠培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中Arg-1mRNA增加，Arg-1為M2型巨噬細(xì)胞的特異基因，表明CS中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞很可能向M2型極化。HA和CS對(duì)巨噬細(xì)胞極化的不同影響可以解釋目前已經(jīng)存在的一些研究結(jié)果，即HA和 CS 在炎癥反應(yīng)中有相反的作用。細(xì)胞移植過(guò)程中，HA被組織中和細(xì)胞分泌的蛋白酶水解為低聚糖的過(guò)程中產(chǎn)生促炎作用［17-18］，而CS則具有抗炎作用［19-20］。本研究中HA和CS對(duì)巨噬細(xì)胞極化的不同影響證實(shí)了它們?cè)诩?xì)胞移植過(guò)程中對(duì)組織的不同影響，為臨床醫(yī)生選擇更優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞移植支架材料提供了參考方案。

本研究HA或CS水凝膠培養(yǎng)48 h的巨噬細(xì)胞中均檢測(cè)出IL-1βmRNA表達(dá)增加，這可能與實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致細(xì)胞損傷，致使其出現(xiàn)炎癥應(yīng)答，釋放IL-1β有關(guān)；此外，水凝膠支架材料的觸碰和擠壓也會(huì)使細(xì)胞損傷，從而釋放IL-1β。本研究不足之處:（1） 檢測(cè)的細(xì)胞因子種類較少，對(duì)不同表型巨噬細(xì)胞其他的特征性細(xì)胞因子尚未檢測(cè)，并且對(duì)氨基聚糖極化巨噬細(xì)胞過(guò)程中啟動(dòng)的信號(hào)通路缺乏驗(yàn)證；（2） 樣本較小，結(jié)果仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，HA可能使巨噬細(xì)胞極化為具有促炎作用的M1型，而CS可能使巨噬細(xì)胞極化為具有抗炎作用的M2型。因此，與HA比較，CS可以減少組織細(xì)胞炎癥損傷，更適合作為細(xì)胞移植的支架材料。