Nin-one結合蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義

熊煜 ，高鑫，王瑾，孫欣，陳藝豐，潘岳陽，王麗萍

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻喉科，沈陽 110004；2.中國醫科大學腫瘤醫院，遼寧省腫瘤醫院頭頸科，沈陽 110042）

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中96%～98%為喉鱗狀細胞癌 （laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）［1］。根據國際癌癥研究署最新發布的GLOBOCAN 2018統計資料顯示，2018年全球約有17.7萬喉癌新發病例，占所有癌癥新發病例的1.0%［2］。國家癌癥中心數據顯示，2015年我國新增喉癌患者約2.64萬，喉癌死亡患者約1.45萬［3］。在我國，東北和華北地區喉癌發病率相對較高，尤其是東北地區，近年來發病率呈增高趨勢［4］。而喉癌患者總體預后仍不理想，其晚期生存率僅為44%［5］。因此，尋求新的喉癌相關治療靶點是早期預防、診斷和制定個體化治療策略的關鍵。Nin-one結合蛋白（Nin-one binding protein，NOB1） 是一種RNA結合蛋白，在核糖體合成、調節細胞周期和RNA代謝中有重要作用［6-9］。研究［10-15］表明，NOB1的異常表達往往會導致細胞惡性增殖。本研究采用免疫組化SP法檢測LSCC中NOB1蛋白的表達情況及其與臨床病理參數的相關性，探討其作為LSCC早期診斷和新的預后標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 標本收集和患者隨訪

收集2009年6月至2016年12月中國醫科大學附屬盛京醫院耳鼻喉科收治的226例LSCC患者的手術標本。所有患者術后病理診斷均為LSCC，且病歷資料完整，術前均未經過放化療。同時收集患者癌旁組織，將45例經HE染色證實的正常黏膜作為對照。226例LSCC患者中，男159例，女67例，平均年齡（60.52±8.41） 歲 （42～79歲）；臨床分期:Ⅰ期27例，Ⅱ期66例，Ⅲ期71例，Ⅳ期62例；臨床分型:聲門上型107例，聲門型91例，聲門下型28例；組織分化程度:低分化26例，中分化104例，高分化96例。生存時間從手術日開始至隨訪日期或者截至由于喉癌復發及其他因素導致患者死亡的日期，按月計算。全部患者隨訪至2019年5月，隨訪時間18～118個月，中位隨訪時間59個月。

1.2 主要試劑

NOB1多克隆抗體 （工作濃度1 ∶200，英國Abcam公司）；SP免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒 （北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 方法

所有標本均用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水，石蠟包埋，3.5 μm連續切片，于70 ℃烤片2 h后，常規脫蠟水化。置于pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復液中，熱修復10 min，冷卻至室溫，然后按SP試劑盒說明進行實驗。于顯微鏡下DAB染色，蒸餾水終止反應。后經蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片。使用PBS溶液取代一抗作為陰性對照，排除非特異性染色。

圖1 NOB1在LSCC組織和癌旁正常黏膜組織中的表達情況 SP×200 Fig.1 Expression of NOB1 in LSCC and normal mucosa tissues SP×200

1.4 結果評估

采用雙盲法對染色結果進行評估，免疫組化染色陽性結果為細胞質和 （或） 細胞核出現淡黃色或棕黃色、棕褐色。每張切片選擇5個有代表性高倍視野 （×200）。根據陽性細胞所占百分比和陽性細胞染色強度，用半定量免疫評分法來判定實驗結果。陽性細胞所占百分比:≤10%，0分；＞10%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。染色強度:不染色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。陽性細胞所占百分比與染色強度相加，0～3分為陰性，＞3分為陽性。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行分析。計數資料應用行×列聯表的χ2檢驗，采用Spearman秩相關分析進行相關性分析。采用Kaplan-Meier法統計患者生存率，采用log-rank法進行生存率差異性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NOB1蛋白在LSCC組織和癌旁正常黏膜組織中的表達

免疫組化染色 （圖1） 顯示，226例LSCC組織中NOB1主要在細胞質中呈彌漫性表達，少數細胞核中也有表達，呈現淡黃色、棕黃色或棕褐色，NOB1陽性表達142例，NOB1陽性表達率為62.8%；45例癌旁正常黏膜組織中NOB1陽性表達6例，NOB1陽性表達率為13.3%。LSCC組織中NOB1的陽性表達率明顯高于癌旁正常黏膜組織，差異有統計學意義（χ2=37.094，P＜ 0.01）。

2.2 LSCC患者中NOB1蛋白表達與臨床病理特征的關系

伴有頸部淋巴結轉移的LSCC患者中NOB1陽性表達率為94.7%，無淋巴結轉移的LSCC患者中NOB1陽性表達率為39.7%，差異有統計學意義（χ2=71.438，P＜ 0.05）。晚期 （Ⅲ～Ⅳ期） LSCC患者中NOB1陽性表達率為76.7%，而早期 （Ⅰ～Ⅱ期） LSCC患者中NOB1陽性表達率為43.0%，差異有統計學意義 （χ2=26.585，P＜ 0.05）。NOB1蛋白表達與LSCC患者的年齡、性別、組織分化程度、腫瘤發生部位無關 （P＞ 0.05）。見表1。

表1 NOB1蛋白表達與LSCC患者臨床病理特征的關系［n（%）］Tab.1 Relationships between the expression of NOB1 and the clinicopathological characteristics of the LSCC patients ［n（%）］

2.3 NOB1蛋白表達與LSCC患者預后的關系

226例LSCC患者中NOB1蛋白陽性表達142例，陰性表達84例。采用Kaplan-Meier法對LSCC患者進行生存分析 （圖2），結果發現，NOB1陽性表達組5年生存率為54.4%，NOB1陰性表達組5年生存率為89.8%。采用log-rank法比較2組的生存率，結果顯示生存率有統計學差異 （χ2=31.277，P＜ 0.05）。

3 討論

圖2 NOB1陽性表達組與陰性表達組患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Survival analysis of NOB1 positive and negative expression groups

NOB1是酵母基因Nob1p的人類同源體，是一種進化保守的蛋白質，含有2個RNA結構域 （N端的PIN結構域和C端的鋅指結構域）［6］，能促進20S蛋白酶體成熟，參與26S蛋白酶體的形成與降解，相當于26S蛋白酶體的亞基，對18S rRNA成熟起關鍵作用［7-8］，參與了核糖體40S小亞基的合成［7，9］。NOB1的異常表達影響蛋白酶體和核糖體的正常合成，造成體內泛素-蛋白酶體途徑異常，從而導致蛋白質降解異常。正常情況下，NOB1蛋白主要在人肺、脾臟和肝臟中表達，同時在食管、腎、結腸、肝、甲狀腺、卵巢等組織中有少量表達［10］。目前一些基礎研究表明，NOB1在腫瘤細胞的惡性增殖中發揮重要作用［11］，其在胃癌［12］、骨肉瘤［13］、甲狀腺乳頭狀癌［14］、前列腺癌［15］、口腔鱗癌［16］等腫瘤組織中的表達均高于正常組織。

本研究發現，與癌旁正常喉黏膜相比，NOB1蛋白在LSCC組織中的表達明顯升高，并與淋巴結轉移、臨床分期相關。已有研究表明，在多種腫瘤組織中NOB1蛋白表達增加，這與本研究發現的NOB1蛋白在LSCC中表達增加的趨勢一致。本研究表明，NOB1的異常表達可能與喉癌頸部淋巴結轉移過程相關。本課題組前期研究［17］發現，沉默NOB1可抑制喉癌Hep-2細胞增殖，抑制細胞周期進程，誘導細胞凋亡，抑制喉癌細胞的遷移和侵襲。本研究發現，喉癌組織標本中NOB1蛋白表達與淋巴結轉移和臨床分期相關。以上研究表明，NOB1可能在LSCC的發生、增殖、侵襲和轉移中有重要的作用。NOB1蛋白高表達提示喉癌預后不良，可作為潛在的評估喉癌患者預后的標志物。