LncRNANeat1在肝細胞癌組織和細胞株中的表達及臨床意義

李芳芳 葛星星 朱堅勝

肝細胞癌是常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率均較高[1]。早期診斷、早期治療、術后隨訪復查是提高肝細胞癌患者5年生存率的重要手段；然而，目前仍缺乏靈敏、可靠的分子生物學標志物。長鏈非編碼RNA（LncRNA）被定義為長度＞200個核苷酸的非蛋白質編碼RNA轉錄物[2]。越來越多研究表明，LncRNA與多種腫瘤有關，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝細胞癌等[3]。LncRNA Neat1是由11號染色體上1個被稱為家族性腫瘤綜合征多發性內分泌腫瘤1型的基因位點轉錄而來，是編碼 Neat1_v1（3.7kb）和 Neat1_v2（23kb）兩種變體的LncRNA[4]。目前已在很多惡性腫瘤中發現LncRNANeat1表達異常，包括神經膠質瘤[5]、人喉鱗狀細胞癌[6]、乳腺癌[7]、胃癌[8]、食管癌[9]等。這些研究認為，LncRNA Neat1異常表達是腫瘤發生、發展的關鍵調節因子，可作為治療干預的潛在靶標。本研究檢測肝細胞癌患者癌組織及其癌旁正常組織以及肝癌細胞株、正常人肝細胞株中LncRNA Neat1的表達，分析肝細胞癌患者癌組織LncRNA Neat1表達與臨床特征的關系，同時探討LncRNA Neat1表達對肝細胞癌的診斷價值，以期為臨床診治提供參考，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2017年12月在浙江省臺州醫院肝膽外科接受手術的16例肝細胞癌患者為研究對象，其中男14例，女2例；年齡36～73（58.81±9.50）歲。納入標準：（1）術后病理檢查證實為肝細胞癌；（2）術前未接受過其他抗癌治療；（3）臨床資料完整。收集所有患者癌組織及癌旁正常肝組織（距腫瘤2 cm以上）標本。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 細胞株培養 正常人肝細胞（LO2）、人高轉移肝癌細胞（MHCC97-H）、人低轉移肝癌細胞（MHCC97-L）均購自上海酶研生物有限公司。使用含10% FBS及雙抗（100 U/ml青霉素+100 mg/L鏈霉素）的高糖DMEM培養基，在37℃、5% CO2的培養箱中進行常規培養。

1.3 資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤部位以及血清甲胎蛋白、ALT、AST、TBil水平等資料。

1.4 癌組織、癌旁正常組織及細胞株中LncRNA Neat1相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。采用Trizol法提取LO2、MHCC97-H、MHCC97-L細胞株以及16例肝細胞癌患者癌組織及其癌旁正常組織的總RNA，采用核酸分析儀檢測所提取RNA的濃度和純度，取適宜純度（1.8～2.0）的RNA進行逆轉錄反應。將RNA逆轉為CDNA，并以其為模板進行qRT-PCR，反應體系20 μl（包括上下游特異性 PCR 引物各 0.3 μl、cDNA 模板 1 μl、滅菌超純水 8.4 μl、SYBR Green I qPCR Master Mix 10 μl；反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，共40個循環。Neat1的引物根據美國生物技術信息中心已發表的LncRNA Neat1序列設計，并由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算 LncRNA Neat1 相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組比較采用配對樣本t檢驗。計數資料組間比較采用Fisher確切概率法。血清ALT、AST、TBil水平與癌組織LncRNA Neat1相對表達量的相關性分析采用Spearman秩相關。繪制ROC曲線分析LncRNA Neat1相對表達量診斷肝細胞癌的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織與癌旁正常組織中LncRNA Neat1相對表達量比較 肝細胞癌組織LncRNA Neat1相對表達量為0.46±0.38，明顯低于癌旁正常組織的1.41±1.05，差異有統計學意義（t=4.435，P＜0.05）。

2.2 患者臨床特征與癌組織中LncRNA Neat1相對表達量的關系 不同腫瘤分化程度患者癌組織LncRNA Neat1相對表達量比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤部位、甲胎蛋白水平患者LncRNA Neat1相對表達量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 2。患者血清 ALT、AST、TBil水平與癌組織LncRNA Neat1相對表達量均未見相關（rs=-0.251、-0.134、-0.296，均 P ＞0.05）。

表2 不同臨床特征患者癌組織LncRNA Neat1相對表達量比較

2.3 LncRNA Neat1相對表達量診斷肝細胞癌的效能LncRNA Neat1相對表達量診斷肝細胞癌的AUC、約登指數、靈敏度、特異度分別為 0.793、0.500、0.875、0.625，見圖1。

圖1 LncRNA Neat1相對表達量診斷肝細胞癌的ROC曲線（LncRNA為長鏈非編碼RNA）

2.4 MHCC97-H、MHCC97-L、LO2 細 胞 株 LncRNA Neat相對表達量比較 MHCC97-H、MHCC97-L、LO2細胞株LncRNA Neat1相對表達量分別為0.24±0.20、0.39±0.08、1.01±0.20，差異有統計學意義（F=18.181，P＜0.05）；與 LO2 細胞株比較，MHCC97-L、MHCC97-H 細胞株相對表達量明顯降低（均P＜0.05）；MHCC97-L與MHCC97-H細胞株相對表達量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

3 討論

有研究表明，肝細胞癌的診斷時間對疾病進展、早期治療的有效性、5年生存率等起著決定性作用[10]。甲胎蛋白是目前臨床上最常用的篩選和診斷肝細胞癌的血清診斷標志物之一，但在急慢性肝炎、肝硬化、妊娠期婦女等人群中也可出現不同程度的升高；此外，有20%～30%的肝細胞癌患者血清甲胎蛋白表達為低水平（陰性結果）。

由于LncRNA在生物體液中較為穩定，已成為癌癥的診斷生物標志物之一[11]。有研究表明LncRNA在腫瘤發生的多個病理過程中起作用，包括細胞增殖、細胞信號傳導、血管生成等[12]。已有多項證據表明LncRNA可以通過調節肝癌干細胞的自我更新能力和其他生物學功能來影響肝細胞癌的發生、發展[13-16]。LncRNA Neat1是幾種癌癥發生、發展的關鍵調節因子，但目前對其在惡性腫瘤中的作用尚不十分明確。Gibb等[17]匯編了272個基因表達的人類系列分析文庫并開發了新的LncRNA發現渠道，結果發現LncRNA Neat1在肝細胞癌組織中的表達水平低于正常組織。但Guo等[18]報道Neat1在肝細胞癌組織中高表達，且與肝細胞癌患者臨床特征密切相關，包括腫瘤數量、大小、轉移以及TNM分期、門靜脈腫瘤栓子狀態、血管侵襲、腫瘤細胞浸潤等。而Xiong等[19]基于57個微陣列和RNA-seq數據集得出的結果證實LncRNA Neat1在肝細胞癌組織中的表達是下調的。

本研究采用qRT-PCR法檢測16例肝細胞癌患者的癌組織及癌旁正常組織以及肝癌細胞、正常人肝細胞中LncRNA Neat1的表達差異，結果顯示肝細胞癌組織、肝癌細胞中的表達分別低于癌旁正常組織、正常人肝細胞，且差異具有統計學意義。筆者進一步分析肝細胞癌患者LncRNA Neat1表達水平與臨床特征的關系，結果發現LncRNA Neat1表達水平與腫瘤分化程度有關，與其他臨床特征（如年齡、性別、腫瘤部位以及血清甲胎蛋白、ALT、AST、TBil水平）等均無關。可見，甲胎蛋白陰性的肝細胞癌患者也可能出現LncRNA Neat1表達異常。提示LncRNA Neat1檢測早期肝細胞癌較甲胎蛋白更靈敏。筆者認為臨床上采用甲胎蛋白聯合LncRNA Neat1檢測將提高肝細胞癌的早期診斷率。本研究還通過繪制ROC曲線分析了LncRNA Neat1的診斷效能，發現AUC、約登指數、靈敏度、特異度分別為0.793、0.500、0.875、0.625，提示 LncRNA Neat1 有望成為診斷肝細胞癌的一種新型腫瘤標志物。然而，本研究與Guo等[17]得出的結果并不一致，筆者認為存在實驗差異的原因，一方面可能是樣本來源、總RNA提取方法、LncRNA Neat1表達檢測方法不同所致；另一方面，LncRNA Neat1 有 2 種變體：Neat1_v1 和 Neat1_v2[4]，盡管這2種變體共享相同的轉錄起始位點，但兩者3′末端加工機制是不同的，這2種轉錄物在腫瘤中可能起不同的作用[20]。Wu等[21]檢測了結直腸癌患者全血、癌組織和癌旁組織中Neat1_v1和Neat1_v2的表達水平，發現Neat1_v1和Neat1_v2在結直腸癌患者全血中均高表達，但腫瘤組織、正常組織中Neat1_v1與Neat1_v2表達差異無統計學意義，同時證明Neat1_v1可以促進腫瘤細胞的生長和侵襲，而Neat1_v2在腫瘤增殖中起到抑制作用。Gao等[22]使用Ficoll-Paque方法分離來自白血病患者和健康人群的外周血白細胞樣品并對Neat1_v1和Neat1_v2進行分析，發現白血病樣本中Neat1_v1的表達水平低于正常樣本，而Neat1_v2表達水平卻與正常樣本相似。從上述研究可以得出，這2種Neat1變體表達的動態變化可能影響Neat1作為癌基因或腫瘤抑制因子的主要功能。目前對Neat1_v1和Neat1_v2在肝細胞癌中的表達模式和作用的研究還十分有限，迫切需要進一步研究來闡明Neat1_v1和Neat1_v2這2種變體在肝細胞癌發生、發展中的確切作用。

綜上所述，本研究結果提示肝細胞癌組織及肝癌細胞株中LncRNA Neat1表達明顯降低，肝細胞癌組織LncRNA Neat1表達與腫瘤分化程度密切相關。LncRNA Neat1有望成為診斷肝細胞癌的新型腫瘤標志物。然而，本研究未闡明LncRNA Neat1在肝細胞癌中發揮作用的具體機制，需要進一步研究明確。