益生菌對腸易激綜合征大鼠內臟高敏感性的作用以及肥大細胞-PAR2-TRPV1通路的影響

田徐露 ,藍 程,田小蘭,崔曉燕 ,王太昊

0 引言

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一種持續發作或間歇性發作的功能性胃腸疾病，具有臨床表現多樣、發病機制復雜、影響因素眾多、病情遷延難愈等特點[1]。近年來，越來越多的證據證實，腸道菌群失調與IBS患者內臟高敏感性、免疫狀態低下等因素有關[2]。根據多項指南推薦，益生菌可用于IBS的預防和/或治療[3]，但是其具體的作用機制尚不明確。Kasakura等[4]發現,益生菌可與肥大細胞表面Toll樣受體結合，抑制肥大細胞(Mast cell，MC)活化脫顆粒。MC活化與組胺、5-羥色胺等活性物質的釋放有關，是介導內臟高敏感性的重要因素[5]。本研究旨在探討雙歧桿菌對IBS大鼠模型內臟高敏感性的影響，以及通過調節蛋白酶激活受體2(Protease activated receptor 2，PAR2)-瞬時感受器電位香草酸受體1(Transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1)軸抑制MC活化的可能機制，為深入闡述益生菌治療IBS的作用機制提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雙歧桿菌三聯活菌膠囊購自上海信誼藥廠有限公司，國藥準字S10950032，規格：0.21 g/粒，含活菌數≥1.0×107CFU，批號：04720170927，4 ℃保存備用。臨用前以2 ml生理鹽水溶解。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、P物質(Substance P，SP)、促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone，CRH)、白細胞介素(Interleukin，IL)-10、IL-12酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；兔抗鼠PAR2單克隆抗體、兔抗鼠TRPV1多克隆抗體、辣根酶標記熒光二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；GenElut糞便DNA分離試劑盒、PCR引物、實時熒光定量PCR試劑盒、抑肽酶均購自美國Sigma公司。

1.2 實驗動物和分組 30只健康雄性SD大鼠，清潔級，(180±20)g，來源于遵義醫學院[許可證號：SCXK(黔)2018-0002]，飼以無菌顆粒飼料，自由飲水。適應性飼養1周后，稱量大鼠體重，按照隨機數字表法將受試大鼠隨機分為3組：空白組、模型組和益生菌組，每組10只。

1.3 動物模型的制備及分組干預 模型組和益生菌組大鼠予以醋酸灌腸+束縛應激，參考張杰等[4]方法進行建模：將大鼠麻醉后，經肛門灌入1 ml乙酸，空白組大鼠灌注1 ml 0.9%氯化鈉溶液，倒立30 s，再用1 ml磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)沖洗結腸，待蘇醒后用膠帶捆綁上肢和前胸進行束縛應激，2 h后松開；連用6 d重復上述操作。通過結腸擴張試驗(Colorectal distension，CRD)觀察大鼠腹部撤離反射(Abdominal withdrawal reflex，AWR)。AWR評分≥1分則造模成功。益生菌組大鼠，每日予以雙歧桿菌三聯活菌膠囊107CFU/(kg·d)灌胃，1次/d，連用14 d。空白組和模型組大鼠予以等體積生理鹽水灌胃。

1.4 大鼠內臟高敏感性檢測 待大鼠禁食12 h后，麻醉，經肛門插入帶氣囊的8F導尿管，置于自制固定裝置中限制大鼠轉身，分別設定容量為15、30、45、60 mmHg進行球囊擴張，每次持續20 s，間隔1～2 min擴張1次，每個容量值重復擴張3次，取平均值。

1.5 大鼠24 h糞便含水量 收集大鼠24 h的糞便，稱量濕重，放入烘箱內烘干2 h，稱量干重，糞便含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6 糞便DNA提取以及16s rRNA高通量測序分析 待實驗結束后，無菌條件下收集大鼠糞便。采用E.Z.N.A Stool DNA Kit提取糞便樣本中的DNA，委托上海生工生物工程有限公司完成測序工作。將下機數據經過濾(設置窗口長度30 bp)后去除低質量reads(≤75%原始read長度)、污染reads(設置adapter和read序列之間的overlap為15 bp，容錯率為3)和低復雜度reads，將通過barcode的高質量clean data用于后期分析。腸道細菌豐度(richness)以每克糞便含檢測到的細菌基因拷貝數表示。并計算雙歧桿菌和大腸埃希菌的比值(B/E值)以代表腸道定植抗力。每個樣品重復檢測3次。

1.7 ELISA檢測 實驗結束后，摘眼球采集血液樣本；離心取上清，采用雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒測定外周血5-HT、SP、CRH、IL-10、IL-12含量。檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.8 結腸組織MC甲苯胺藍染色 實驗結束后，截取大鼠距離肛門約8 cm處的結腸組織，置于Carnoy固定液中固定4～6 h，進行石蠟包埋組織切片。經二甲苯脫蠟和梯度(100%～95%)酒精脫蠟至水后，用甲苯胺藍染色10 min，冰醋酸分化，二甲苯透明，中性樹脂封片。MC呈紫紅色染色，細胞核呈藍色。

1.9 脊髓背根神經節(Dorsal root ganglion，DRG)Western blot檢測 實驗結束后，剝離背部皮膚組織，截取L6-S1椎體，在冰浴中挑取脊髓組織約100 mg，加入蛋白酶裂解液，提取總蛋白，取20 μg蛋白樣本，進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，脫脂牛奶封閉后，加入PAR2抗體或TRPV1抗體，按1∶50稀釋，避光孵育過夜。Pro-light HRP發光試劑盒檢測，掃描PAR2和TRPV1蛋白條帶積分光密度值(IOD)，進行半定量分析。

2 結果

2.1 益生菌對大鼠內臟高敏感性的影響 給藥14 d后行CRD擴張實驗，與空白組比較，模型組大鼠在不同壓力擴張情況下AWR評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。益生菌組大鼠AWR評分較模型組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；而且與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 益生菌對大鼠糞便含水量的影響 入組時，三組大鼠糞便含水量差異無統計學意義(P>0.05)，造模后，模型組和益生菌組大鼠糞便含水量明顯高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。而實驗結束時，益生菌組大鼠糞便含水量顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；但是與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 實驗結束時三組大鼠不同壓力擴張情況下AWR評分

表2 三組大鼠糞便含水量比較(%)

2.3 益生菌對大鼠腸道菌群含量的影響 給藥14 d后，與空白組比較，模型組大鼠腸道大腸埃希菌、腸球菌豐度升高，而雙歧桿菌、乳酸桿菌豐度和B/E比值降低，差異有統計學意義(P<0.05)。而與模型組比較，益生菌組大鼠腸道大腸埃希菌、腸球菌豐度顯著降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌豐度和B/E比值則顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而且與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 三組大鼠腸道菌群含量比較(%)

2.4 益生菌對大鼠血清中5-HT、SP、CRH、IL-10、IL-12含量的影響 給藥14 d后，與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT、SP、CRH、IL-12水平升高，而血清IL-10水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，益生菌組大鼠血清5-HT、SP、CRH、IL-12水平顯著降低，而血清IL-10水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.5 益生菌對大鼠結腸組織肥大細胞浸潤水平的影響 經甲苯胺藍染色，與空白組[(1.20±0.92)個/HP]相比，模型組[(3.10±1.29)個/HP]大鼠結腸組織MC浸潤明顯增加；而益生菌組[(1.50±1.27)個/HP]大鼠結腸組織MC浸潤數量相對模型組減少，三組MC浸潤數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.6 益生菌對大鼠DRG組織PAR2、TRPV1蛋白表達的影響 經Western blot法，與空白組相比，模型組大鼠DRG組織PAR2和TRPV1蛋白表達量升高；而益生菌組大鼠DRG組織PAR2和TRPV1蛋白表達量相對模型組減少。見圖2和表5。

表4 三組大鼠血清中5-HT、SP、CRH、IL-10、IL-12含量比較

圖1 甲苯胺藍染色法檢測各組大鼠結腸組織MC浸潤情況(400×)

表5 三組大鼠DRG組織中PAR2蛋白和TRPV1蛋白表達比較

圖2 Western blot法檢測各組大鼠DRG組織PAR2蛋白和TRPV1蛋白表達情況

3 討論

IBS是臨床上常見的消化系統紊亂綜合征，與腸道菌群紊亂密切相關。人體腸道菌群種類多達上千種，絕大多數屬于雙歧桿菌和類桿菌等專性厭氧菌，這部分屬于共生菌[6]，此外，中間性菌群占很少一部分，例如，大腸埃希菌、腸球菌等，介于共生菌和致病菌之間，有明顯的生理作用，但是也存在潛在的致病性[7]，若繁殖失控易損傷腸道黏膜屏障，增加腸道通透性，導致菌群向腸外轉移，而且可誘導多種炎癥因子分泌及免疫細胞增殖、活化等，釋放5-HT、CRH、SP等活性物質，導致內臟高敏感性，進而增加機體對疼痛的感知。益生菌一般包括雙歧桿菌、枯草桿菌、乳桿菌等，受胃酸或腸道酶解的影響較小[8]。根據耶魯和哈佛益生菌工作組發表的益生菌應用共識[9]，B級推薦雙歧桿菌可用于IBS的治療。但是目前關于益生菌的作用機制尚不明確，對臨床應用有一定的影響。

本研究采用傳統的醋酸灌腸方法造模，但是本文的研究目的是探討益生菌對IBS的治療機制，因此，需要在造模成功后開始給藥；考慮到單純使用醋酸灌腸，隨著時間推移，大鼠內臟高敏感性指標會逐漸減弱，不利于實驗的進行。因此，我們在采用醋酸灌腸的同時，加上了束縛應激方法，通過檢測實驗結束時各組大鼠AWR評分，發現模型組大鼠較好地維持了內臟高敏感性，而且腸道菌群失調情況與空白組也存在顯著差異，同時結合大鼠排便情況，證實由該復合因素建立的IBS大鼠模型可支持本實驗研究。而與模型組大鼠相比較，不同壓力擴張情況下，AWR評分和糞便含水量均明顯降低，提示益生菌對于緩解大鼠內臟高敏感性療效顯著。需要說明的是，雖然本研究中益生菌組大鼠AWR評分和糞便含水量與空白組比較差異沒有統計學意義，但是考慮到動物模型僅能夠模擬IBS的臨床癥狀和病變機制，與臨床實際IBS并不完全相同，IBS實際屬于慢性進展性疾病，內臟高敏感性屬于持續狀態，因此，仍舊不能斷定益生菌可使得IBS模型大鼠內臟高敏感性恢復至空白組水平，需要通過后續機制研究證明。

近年來，隨著神經胃腸病理學的發展，腦-腸軸學說對于闡述IBS的發病機制提供了新的思路。腦腸肽(包括5-HT、CRH、SP等)在內臟高敏感性發生過程中發揮著重要作用[10]。在本研究中，模型組大鼠血清中5-HT、CRH、SP含量較空白組明顯升高，說明IBS大鼠內臟高敏感性與中樞神經系統分泌的活性物質有關。例如，陳剛等[11]發現，IBS患者外周血中SP、5-HT、神經肽Y(NPY)水平高于健康對照組，而且與腹瀉癥狀和焦慮抑郁狀態有關。CRH是一類介導各種機體應激反應的重要神經遞質，主要分布于情感相關區域，通過促進5-HT的釋放，增加內臟高敏感性、焦慮、抑郁等狀態[12]。SP也是由多肽能神經元分泌的一類信號傳導因子，通過激活血小板釋放5-HT，導致胃腸蠕動功能紊亂[13]。在本研究中，益生菌組大鼠血清SP、5-HT、CRH水平顯著低于模型組，說明益生菌對腦-腸軸異常機制有一定的調節作用，但是與空白組相比仍然較高。

另外，益生菌對腸道菌群紊亂也有顯著的改善作用，益生菌組大鼠B/E比值與空白組接近，而且血清IL-10水平升高、IL-12水平降低，說明大鼠腸道內共生菌數量增加，這也可能是改善腸道炎癥反應的重要原因。IBS大鼠模型腸道低腸道炎癥狀態與脫顆粒MC浸潤數量也密切相關。MC屬于典型的促炎因子細胞，在腦-腸軸信號轉導過程中發揮著重要作用[14]。在本研究中，模型組大鼠結腸組織中MC浸潤數量顯著增加，而且脫顆粒MC多分布于神經元周圍，導致機體疼痛閾值或感覺閾值降低。MC釋放的活性物質可傳入DRG中的PAR2受體，通過與TRPV1蛋白結合，導致神經元興奮性增加。Cenac等[15]通過敲除小鼠PAR2基因，發現DRG中Ca2+內流及結腸、直腸擴張引起的腹部肌肉收縮都不受MC脫顆粒的影響，說明MC-PAR2-TRPV1軸與IBS內臟高敏感性有關。在本研究中，益生菌組大鼠結腸組織MC浸潤數量減少，DRG組織PAR2和TRPV1蛋白表達量也相應降低，說明益生菌對MC-PAR2-TRPV1軸激活有一定的抑制作用。

綜上所述，IBS大鼠模型腸道菌群失調導致低炎癥狀態和內臟高敏感性，而益生菌可通過抑制MC-PAR2-TRPV1軸激活改善IBS大鼠內臟高敏感性，本研究為益生菌作用機制的研究和臨床應用的推廣提供一定的理論支持。