紅景天苷通過調控Nrf2表達對db/db型鼠糖尿病腎病保護作用的研究

殷白丁，胡玉霞，靳 紅，吐達洪，汪 晶*

0 引言

糖尿病的微血管并發癥在糖尿病中占有相當大的比例[1]。其中，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病對腎臟組織最嚴重的一種損傷，是終末期腎臟疾病和腎衰竭的主要原因[2-3]。研究表明，大約有15%～40%的1型或2型糖尿病患者患有DN[4]。除了慢性持續性高血糖，包括慢性炎癥、血脂障礙和高級糖基終產物(Advanced glycation end products,AGEs)積累在內的其他因素也能很大程度上影響DN的發病和進程[5]。

AGEs與DN的發病機制密切相關，氨基胍和吡多胺等AGEs抑制劑能減輕糖尿病患者的腎損害[6]。研究表明，AGEs不但能與其受體發生相互作用，隨之改變細胞內發出促進炎性細胞因子釋放的信號，還能與其他通路相互溝通[7]。糖尿病中過多的AGEs會觸發細胞凋亡通路，AGEs誘導的凋亡能引起基底膜增厚，最終導致腎小球功能喪失[8]。DN的動物模型闡釋了抑制AGEs形成或抑制AGEs誘導凋亡的藥物都具有一定的腎臟保護作用。

細胞核因子2相關的因子2/抗氧化反應元素(Nrf2/ARE)發出的信號在控制編碼內生抗氧化酶基因轉錄調節中發揮著關鍵作用[9]。第Ⅱ階段抗氧化酶包括血紅素加氧酶-1(HO-1)、煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸[NAD(P)H]奎寧氧化酶-1(NQO-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)。有報道，由于有抑制氧化應激、提高腎臟保護功能的作用，Nrf2介導的抗氧化酶成為了一種有前途的治療靶點[10]。

Sal是一種從中藥紅景天中分離出來的植物皂苷，可以治療心血管疾病和腦血管疾病[11]。文獻報道，Sal通過抑制BIM介導的大鼠近端腎小管細胞凋亡對DN起保護作用[12]。此外，Sal通過上調opg/rankl比率改善卵巢切除糖尿病大鼠的骨組織形態并防止骨丟失[13]。然而，Sal對于DN的作用尚未明確，相關分子機制也仍不清楚。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料 紅景天苷購自上海阿拉丁生物科技發展有限公司(上海，中國)。二甲雙胍(中美施貴寶制藥有限公司，上海，中國)作為陽性對照。細胞培養材料:杜爾貝科修改鷹介質(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素均購自Gibco(上海，中國)。3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化銨(MTT)、鋅原卟啉(ZNPP)和其他化學用品均購自西格瑪·奧爾德里奇(美國)。AGE測定試劑盒購自上海韋斯坦生物科技有限公司。Caspase-3以及caspase-9細胞活性試劑盒(碧云天，中國)，Nrf2(sc-13032)、Bcl-2(sc-7382)和Bax(sc-4239)購自圣克魯斯生物技術公司。其他相關試劑以及β-actin均購自碧云天生物科技有限公司(上海，中國)。

AGE/牛血清白蛋白(BSA)的制備：根據Zhang等[3]的方案制備了AGE-BSA。用0.792 6 g D-葡萄糖在37 ℃下培養8周，將0.07 g牛血清白蛋白加入PBS中。對照白蛋白在沒有葡萄糖的情況下培養。使用皮爾斯內毒素去除凝膠去除內毒素，并使用毒素傳感器TM顯色LAL，內毒素檢測試劑盒(金斯瑞生物科技，美國)檢測內毒素，規格小于500 U/L。

1.2 動物和分組 雌性db/db鼠(db/db mice)和C57BL/6J鼠(db/m，6～8周齡)均購自維通利華動物研究中心(北京，中國)。實驗所有動物均在標準條件(室溫22 ℃，濕度60%，光/暗循環)下培養，并攝入標準顆粒物以及足夠飲用水。所有動物實驗均已被中國醫學科學院實驗動物委員會和北京協和醫學院批準，并按照美國衛生部出版的《國家實驗動物保健和使用指南》(NIH第85-23號出版物，1996年修訂)進行操作。在戊巴比妥麻醉下進行所有動物實驗和處死，并且盡可能讓動物少遭受痛苦。

1.3 實驗方案 所有實驗動物進入相應培養環境適應2周后，采用血糖儀(Roche)測量尾血糖水平。將空腹血糖>200 mg/dl的db/db型鼠視為糖尿病，并用于進一步的實驗。將鼠隨機分為4組(n=8)：C57BL/6組(對照組)；db/db組(模型組)；db/db+二甲雙胍200 mg/(kg·d)組(MET組)；db/db+二甲雙胍200 mg/(kg·d)+紅景天苷30 mg/(kg·d)組。用灌胃的方法給藥20周。將灌胃處理20周后的對照組和模型組鼠放在代謝籠中,測量其糖尿病相關指標。

1.4 血生化指標檢測

1.4.1 空腹血糖、血清TCH和TG水平檢測 每4周測量1次過夜禁食鼠的空腹血糖(FBG)水平。20周后，用頸椎離斷法處死實驗動物。處死前從眼眶后靜脈叢采樣，用生化試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)測定血清總膽固醇(TCH)和三酰甘油(TG)水平。

1.4.2 血清β2-微球蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、AGE和尿白蛋白水平檢測 離心法(1 000×g，10 min，4 ℃)分離各組血樣中的血清樣品。按照說明書使用多模式酶標儀(Synergy Hi、Biotek、Winooski、VT、USA)和商用試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)測定β2-MG、BUN、CR和AGE水平。根據說明(KA0489，Abnova，臺北，臺灣)使用白蛋白(鼠)ELISA試劑盒測量尿白蛋白。尿白蛋白排泄量以24 h排泄總量表示。

1.5 組織病理學檢查 將腎臟樣本固定在4%的緩沖多聚甲醛中，脫水后嵌入石蠟中。每個嵌入樣本切下厚約4 μm的切片，并用蘇木精和伊紅(HE)染色，使用光學顯微鏡進行檢查。

1.6 細胞培養 人腎近端小管(HK-2)細胞購自中國科學院(上海)細胞庫，在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM(葡萄糖含量5.5 mmol；Gibco，上海，中國)的培養基中，37 ℃、5%CO2的孵箱中培養。所有細胞根據實驗設計以適當的密度鋪滿培養皿中，并在實驗前培養24 h以達到60%～70%的濃度。

1.7 細胞活性測定 MTT法測定HK-2細胞的細胞活性。在96孔板(1×104個細胞/孔)中培養，細胞經不同處理后，在37 ℃的溫度條件下，用MTT溶液(1 mg/ml最終濃度)培養4 h。二甲基亞砜(DMSO，150 μl/孔)溶解，用酶標儀在570 nm波長處檢測不同孔的吸光度。用MTT降低的百分比表示細胞活性。按照caspase-3以及caspase-9活性試劑盒操作流程檢測HK-2細胞的細胞活性。用酶標儀檢測相應的吸光度。

1.8 Western blot實驗 用含1%苯甲磺酰氟醚的蛋白質提取試劑盒(CoWin Bioscience Co.，Ltd.，Beijing，China)分離細胞質和細胞核蛋白。通過電泳的方法在10% SDS-PAGE凝膠上分離等量(60～80 μg)的蛋白質，并將其轉移到硝酸纖維素膜(Millipore Corporation公司，美國)上。在含有5%(w/v)脫脂奶粉(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA，TBST)中室溫封閉2 h。然后用適當的一抗在4 ℃條件下孵育過夜。之后，用TBST進行3次洗滌，并室溫下二抗孵育2 h。用增強化學發光法進行結果觀察。

1.9 統計學分析 采用單因素方差分析和紐曼-科伊爾斯檢驗法檢測實驗數據。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sal對db/db型鼠血清中FBG、TCH和TG水平的影響 Sal以及MET治療20周后，與模型組相比，Sal以及MET能夠明顯降低db/db鼠血清中FBG的含量(圖1A)。與模型組相比，Sal或MET能夠明顯逆轉db/db鼠血清中TCH和TG水平的降低(圖1B)。

2.2 Sal對db/db型鼠腎功能的影響 與對照組相比，db/db組24 h尿量和尿蛋白水平明顯升高(P<0.01)。MET和Sal處理20周后24 h尿量和尿蛋白水平明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，模型組β2-MG、CR和BUN表達水平明顯升高，分別增加了115.31%、143.48%和93.11%(P<0.01)。MET和Sal能夠明顯抑制β2-MG、CR和BUN水平的升高。且Sal組β2-MG、CR和BUN水平分別降低了22.93%、54.07%和15.33%(P<0.05)。Sal和MET能明顯抑制模型組血漿中AGEs的表達。見圖2。

2.3 紅景天苷對組織病理學變化的影響 HE染色結果顯示，與對照組相比，糖尿病模型組腎小球體積增大，腎小球膜細胞增殖異常增加。模型組腎臟組織出現明顯的炎性浸潤區(圖3A)。Sal和MET能夠減輕模型組腎臟結構異常(圖3A)。如圖3B所示，與對照組相比，模型組中TGF-β1和膠原蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。Sal以及MET能夠明顯降低TGF-β1和膠原蛋白表達增加(P<0.05)。

2.4 Sal逆轉AGE誘導的HK-2細胞死亡 AGEs(0、50、100、200、400 μg/ml)刺激HK-2細胞24 h后，HK-2細胞活性呈濃度梯度樣降低。Sal(25 μmol/L，24 h)能夠逆轉由AGE(400 μg/ml)誘導的HK-2細胞活力以及LDH表達降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 Sal對AGE誘導HK-2細胞凋亡的影響 與對照組相比，Sal可以逆轉AGEs誘導的HK-2細胞活性降低。Sal逆轉AGEs誘導HK-2細胞中Bcl-2表達上調以及Bax表達下調；Sal逆轉AGE導致的HK-2細胞中caspase-3和caspase-9的活性升高(P<0.05)。Sal能夠逆轉由AGEs誘導的Nrf2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖5。

圖1 紅景天苷對db/db型鼠FBG、TCH和TG水平的影響

圖2 紅景天苷對db/db鼠尿蛋白量和腎功能指標的影響

圖3 紅景天苷對組織病理學變化的影響

圖4 Sal逆轉由AGEs誘導的HK-2細胞死亡

圖5 Sal對AGE誘導HK-2細胞凋亡的影響

3 討論

DN是糖尿病患者發生的一種進行性微血管并發癥，其特點為腎臟微血管破裂，腎小球毛細血管和腎小管間質受到損害[1]。研究表明，慢性高血糖誘導的氧化應激可以引發DN的退行性通路[4]。氧化應激不僅能導致DN中蛋白尿發病機制的重要因素-足細胞凋亡，還可以加速腎小球系膜細胞(MC)增殖以及細胞外基質(ECM)蛋白過量增多[10]。本研究表明，Sal對AGEs處理的db/db型糖尿病鼠和HK-2細胞的凋亡均有保護作用。db/db鼠表現出特征性腎臟功能紊亂，包括FBG、TG、TCH、BUN和CR水平升高以及腎小球結構異常。而Sal及MET均可以降低db/db鼠的尿白蛋白，降低血清TG、TCH、BUN、CR以及β2-MG的水平，減輕腎的病理結構變化程度，使TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ的表達水平下調，對DN的保護作用很明顯。此外，Sal通過促進Nrf2在AGEs處理的糖尿病鼠和HK-2細胞中的表達，抑制細胞凋亡。

研究表明，TGF-β信號通路是DN發展中起關鍵作用的一條通路，且在糖尿病患者和動物模型的腎小球中被激活[14]。研究發現，AGEs可以誘導TGF-β信號激活[15]。本研究結果表明，AGEs處理的糖尿病鼠和HK-2細胞中TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ表達均上調，Sal能夠逆轉由AGE誘導的TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ表達上調，表明Sal可能通過抑制TGF-β1通路抑制糖尿病誘導的纖維化。同時，AGEs可降低HK-2細胞活性，增加細胞LDH表達，而Sal能夠逆轉由AGEs誘導的細胞死亡。以上結果表明，Sal可通過減輕AGEs誘導的損傷起到保護作用。

綜上所述，Sal通過促進Nrf2表達來調節線粒體凋亡途徑，進而參與了DN對于腎臟細胞的損傷，產生與MET相似的作用。同時，本研究結果表明，Sal可能對除葡萄糖控制以外的DN具有潛在的治療作用。