芪參益氣滴丸對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制

陳家顯 ,劉先霞,陳躍武,陳磊,張遠生,陳勁松

（1.海南醫學院第二附屬醫院心血管內科，海南 海口 570311；2.南華大學附屬第二醫院心血管內科，湖南 衡陽 421001）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一種常見的心血管疾病，也是各種心臟疾病的終末期表現，近年來其發病率呈上升趨勢，且因其具有高發病率和高死亡率的特點已引起研究者高度關注［1］。目前CHF 的治療仍以藥物治療為主，西藥控制心力衰竭進展及改善癥狀有良好的效果，但其局限于對癥處理，且藥物不良反應明顯。中醫藥治療心血管疾病已體現出其獨特優勢，近年來的研究［2-3］表明：中醫藥治療心血管疾病療效確切，安全性高，且具有多靶點、多層次和多環節等優勢。芪參益氣滴丸（Qishen-Yiqi Dropping Pill，QSYQ）是治療氣虛血瘀型胸痹的中藥制劑，主要由黃芪、丹參、三七和降香組成，具有益氣活血的功效，臨床廣泛地應用于冠心病及心力衰竭的治療，并取得了良好效果［4-5］，但其作用機制尚未明確。本研究通過觀察CHF 大鼠心臟超聲表現、心肌細胞形態、氧化應激水平及細胞凋亡蛋白的表達，探討QSYQ 對心力衰竭發生時氧化應激水平和心肌細胞凋亡的影響，闡明其在CHF 發生發展過程中的保護作用及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器無特定病原體（SPF）級雄性SD 大鼠60 只，鼠齡6～7 周，體質量（220±20）g，由湖北省動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（鄂）2018-0027。大鼠飼養條件：溫度24℃，濕度50%，通風良好，明暗光照交替12 h，標準飼料喂養，自由進食及飲水。適應環境1 周，術前禁食24 h，不禁水。QSYQ（批號150906）購于天津天士力制藥集團股份有限公司，卡托普利（批號H31022986）購于中美上海施貴寶制藥有限公司，蘇木素、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒和活性氧（ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）、核因子E2 相關因子2（Nrf2）和血紅素氧化酶1（HO-1）抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司。ACUSON X300 超聲心動圖儀購于德國西門子公司，RX50M 正置顯微鏡和攤片機購于德國徠克顯微系統有限公司，UniCel DxC600全自動生化分析儀購于美國Beckman Coulter 公司，Tanon-3500（R）全自動數碼凝膠圖像分析系統購于上海天能科技有限公司，Varioskan LUX 酶標儀購于美國Thermo Fisher Science 公司。

1.2 實驗動物模型制備和分組60 只SPF 級雄性SD 大鼠，適應性飼養1 周后，隨機分為假手術組、模型組、陽性藥對照組（6.75 mg·kg－1·d－1卡托普利）［6-7］、低劑量（135 mg·kg－1·d－1）QSYQ 組和高劑量（270 mg·kg－1·d－1）QSYQ 組，每組12 只。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，采用冠狀動脈前降支結扎法建立CHF 模型（假手術組不結扎冠狀動脈）［8］，造模結束后利用超聲心動圖儀檢測大鼠心功能，左室射血分數（ejection raction，EF）≤50%視為CHF 造模成功［9-10］，術后24 h 灌胃給藥，連續4 周，其中假手術組和模型組大鼠每天給予其他3 組等量生理鹽水灌胃。

1.3 超聲檢查各組大鼠灌胃4 周后進行心臟超聲檢測，記錄左室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVSD）、左室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVDD）、EF 和左室短軸縮短率（left ventricular short-axis shortening rate，FS）。

1.4 TUNEL 法檢測大鼠心肌組織細胞凋亡率3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取左室心肌組織，洗凈后用10%甲醛固定24 h 后脫水處理，常規石蠟包埋，制作3～4 μm 厚度的石蠟切片，采用脫TUNEL 標記凋亡的細胞核。于200 倍視野計數凋亡細胞數，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5 大鼠血清中LDH和SOD 活性及MDA 水平大鼠腹主動脈取血，4℃條件下3 000 r·min－1離心10 min，取血清。按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后于440 nm 波長處檢測各樣品吸光度（A）值，根據試劑盒操作說明書提供的計算公式分別計算LDH 和SOD 活性及MDA 水平。

1.6 大鼠心肌組織中ROS 水平檢測取大鼠左室心肌組織，在預冷的PBS 緩沖液中漂洗，加入適量胰酶消化液，37℃消化30 min，間斷性吹打已消化組織，用預冷PBS 緩沖液終止消化，采用300 目尼龍網過濾，收集細胞，500 r·min－1離心10 min，棄上清，重懸細胞，重懸后按照試劑盒操作說明書步驟進行，加入10 μmol·L－1DCFH-DA 熒光探針避光孵育30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，使用488 nm 激發波長、525 nm 發射波長，采用流式細胞儀檢測，以相對平均熒光強度值表示細胞內ROS 水平。

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平取大鼠左室心肌組織，稱質量后加入預冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，冰上碾磨組織，4℃條件下12 000×g 離心20 min，收集上清，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將蛋白轉移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1 和β-actin 抗體，4℃孵育過夜。次日，加入相應二抗室溫孵育1 h，ECL 試劑曝光顯影，在全自動凝膠成像系統中曝光顯影，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠LVSD、LVDD、EF 和FS，心肌細胞凋亡率，血清中LDH 和SOD 活性及ROS 和MDA 水平，心肌組織中cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均符合正態分布，以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標與假手術組比較，模型組大鼠LVSD 和LVDD 明顯升高（P＜0.05），EF 和FS 明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組和陽性藥對照組大鼠LVSD 和LVDD 明顯降低（P＜0.05），EF 和FS 明顯升高（P＜0.05），低劑量QSYQ 組大鼠心功能指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標Tab.1 Cardiac function indexes of rats in varions groups（n＝12,）

表1 各組大鼠心功能指標Tab.1 Cardiac function indexes of rats in varions groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況假手術組大鼠心肌組織TUNEL 染色切片中棕黃色細胞不明顯，細胞凋亡率為（5.67±0.62）%；模型組大鼠心肌細胞棕黃色細胞明顯增多，細胞凋亡率為（39.40±3.07）%，較假手術組明顯升高（P＜0.05）；高劑量QSYQ 組和陽性藥對照組大鼠心肌組織中棕黃色細胞明顯減少，細胞凋亡率分別為（15.65±1.90）%和（9.84±0.88）%，較模型組明顯降低（P＜0.05），低劑量QSYQ 組大鼠肌細胞凋亡率與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.3 各組大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平與假手術組比較，模型組大鼠血清中LDH 活性和MDA 及ROS 水平明顯升高（P＜0.05），SOD 活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組和陽性藥對照組大鼠血清中LDH 活性及MDA 和ROS 水平明顯降低（P＜0.05），SOD 活性明顯升高（P＜0.05），低劑量QSYQ 組大鼠血清中上述各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平Tab.2 Activities of LDH and SOD and levels of MDA and ROS in serum of rats in various groups（n＝12,）

表2 各組大鼠血清中LDH 和SOD 活性及MDA 和ROS 水平Tab.2 Activities of LDH and SOD and levels of MDA and ROS in serum of rats in various groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組和陽性藥卡托普利組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3 和Bax 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），低劑量QSYQ組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2 和表3。

圖2 各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax和Bcl-2 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of leaved-Caspase-3，Bax，and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Cleaved-Caspase-3,Bax,and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝12,）

表3 各組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Cleaved-Caspase-3,Bax,and Bcl-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

2.5 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），陽性藥對照組和低劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3 和表4。

圖3 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in varions groups（n=12,）

表4 各組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in myocardium tissue of rats in varions groups（n=12,）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

3 討論

CHF 是由于長期心臟負荷過重，心肌損害和收縮力減弱所致的心功能不全的一種綜合征，也是眾多心臟疾病的終末階段，病死率極高［11］。我國中草藥資源豐富，種類繁多，從中草藥的有效成分中探尋并開發對抗心力衰竭藥物意義重大。近年來有研究［12-13］報道：QSYQ 在治療心力衰竭、改善心臟功能、提高運動耐量及抑制炎癥反應等方面具有良好效果。本研究采用冠狀動脈前降支結扎法建立大鼠CHF 模型，并給予QSYQ 治療心肌損傷，應用超聲檢測各組大鼠心功能，結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠LVSD 和LVDD 明顯升高，而EF 和FS 明顯降低，提示CHF 模型構建成功；與模型組比較，高劑量QSYQ 組大鼠LVSD 和LVDD 明顯降低，EF 和FS 明顯升高，表明QSYQ可明顯改善CHF 模型大鼠心臟功能。

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內氧自由基產生過多，清除能力降低，導致氧化系統和抗氧化系統失衡，從而引起的氧化損傷過程。氧自由基可改變心臟結構而造成心臟功能異常，參與心力衰竭的演變進程。近年來研究［14］表明：心力衰竭動物模型中氧自由基明顯增多，抵抗被氧化的能力降低。當氧自由基抵抗物質活性降低或產生過度時，將導致氧自由基沉積，進而刺激細胞膜脂質發生過氧化反應［15］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清中LDH 活性及MDA 和ROS 水平明顯升高，SOD 活性降低，機體內的氧化與抗氧化平衡被打破，產生氧化應激損傷；與模型組比較，高劑量QSYQ 組大鼠血清中LDH活性及MDA和ROS水平明顯降低，SOD活性升高，表明QSYQ 可以通過降低CHF 模型大鼠機體內的氧化應激水平，緩解氧化損傷。

氧化應激可導致心肌細胞結構破壞和功能異常，進而導致心肌細胞凋亡增加，從而引起心功能損害，發生心力衰竭。細胞凋亡的發生由細胞凋亡蛋白調控，Bcl-2 家族蛋白在細胞凋亡過程中起著重要作用，Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平與凋亡調控直接相關。在外界刺激或Caspase-3 等因子活化時，Bax 從胞漿轉入線粒體或細胞核膜，導致促凋亡因子與抗凋亡因子失衡，誘導細胞凋亡［16-17］。本研究采用TUNEL 染色觀察各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況，結果顯示：假手術組大鼠心肌組織TUNEL染色切片中棕黃色細胞不明顯，細胞凋亡率低，模型組大鼠心肌組織中棕黃色細胞明顯增多，細胞凋亡率明顯升高，高劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中棕黃色細胞明顯減少，細胞凋亡率明顯降低；Western blotting 實驗檢測結果顯示：QSYQ 能明顯降低CHF 大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Bax 和Cleaved-Caspase-3 的表達水平，同時上調Bcl-2 蛋白的表達水平，起到抗心肌細胞凋亡作用。

Nrf2/HO-1 信號通路是迄今發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路之一，機體內多種抗氧化酶都含有一個共同的啟動子序列——抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE），在與ARE結合的多種轉錄因子中，Nrf2 是目前被認為起關鍵作用且可被外界因素誘導的，當發生氧化應激或受到其他化學物質刺激時，Nrf2 通過磷酸化與Keap1解耦連，激活Nrf2 進入細胞核，與ARE 特異性位點結合，進而誘導其下游表達一系列內源性的保護基因［18］。HO-1 為Nrf2 重要的下游靶基因，且為一種新型的心肌保護因子［19-20］。本研究結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低；與模型組比較，陽性藥對照組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平差異無統計學意義，可能與卡托普利的作用機制有關，其可以通過擴張血管而控制血壓，減輕心臟負荷來阻滯CHF 的進行性心室擴張［21］。而高劑量QSYQ 組大鼠心肌組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯升高，表明QSYQ 可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，來發揮對CHF 模型大鼠心肌組織的保護作用。

綜上所述，QSYQ 可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路抑制CHF 模型大鼠心肌組織的氧化損傷，發揮其對心肌細胞損傷的保護作用。本研究揭示了QSYQ 潛在的心肌保護作用機制，為其相關藥物的開發和臨床應用提供了實驗依據。