人參皂苷對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張聰 ,劉迪,張寒雪,張浩,孔繁利,馮憲敏

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,吉林 吉林 132013）

氧化應(yīng)激是指由于某種原因體內(nèi)產(chǎn)生了超出機(jī)體清除能力的多余活性氧（reactive oxygen species，ROS），使機(jī)體正常情況下存在的氧化/還原平衡狀態(tài)被破壞，體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子物質(zhì)氧化損傷和功能紊亂，影響機(jī)體正常代謝過程的一種異常應(yīng)激狀態(tài)［1］。氧化應(yīng)激是引起機(jī)體衰老、炎癥和多種慢性疾病（糖尿病和高血壓等）的主要原因之一［2］。人參皂苷是人參屬藥材中的一種固醇類化合物，是人參的主要活性成分之一，目前已知的人參皂苷約有幾十種，其具有抗腫瘤、抗氧化和抗疲勞等多重功效，其中人參皂苷Rb1 和Rg1在抗氧化應(yīng)激的功效方面較為出色，具有治療氧化應(yīng)激介導(dǎo)疾病的潛力，也是在人參皂苷抗氧化應(yīng)激研究中應(yīng)用最普遍的2 種皂苷。近年來，人參皂苷在國內(nèi)外許多抑制氧化應(yīng)激的研究中發(fā)揮了良好的抗氧化作用，其中核因子相關(guān)因子E2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和核轉(zhuǎn)錄因子 κB（nuclear transcription factor-kappaB，NF-κB）是人參皂苷抗氧化應(yīng)激機(jī)制研究中涉及到最多的2 種蛋白［3-7］。然而，氧化應(yīng)激是一種涉及多條通路、影響機(jī)體多種功能的復(fù)雜病理過程，僅研究其中一兩條相關(guān)通路并不能全面闡明其作用機(jī)制，逐步探索人參皂苷抑制氧化應(yīng)激所涉及到的其他信號(hào)通路，構(gòu)建完整的氧化應(yīng)激通路網(wǎng)絡(luò)，對(duì)人參皂苷治療和預(yù)防氧化應(yīng)激及其相關(guān)疾病具有重要意義。本研究采用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷，并采用人參皂苷RH1、F1、RD、RO 和RE 對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，根據(jù)各種人參皂苷對(duì)HepG2 細(xì)胞的保護(hù)和毒性作用，綜合考量選擇其中一種，建立HepG2 細(xì)胞的氧化損傷及保護(hù)模型，旨在考察人參皂苷對(duì)氧化損傷HepG2 細(xì)胞的保護(hù)作用，為后續(xù)闡明人參皂苷抗氧化應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2 細(xì)胞由北華大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。人參皂苷RH1、F1、RD、RO 和RE（純度≥98%）（中國藥品生物制品檢定所）。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、PBS 緩沖液、胰酶和平衡鹽溶液（HBSS）（美國Gibco 公司），二甲基亞砜（DMSO）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）和水溶性維生素E（Trolox）（美國Sigma 公司），細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）（日本同仁化學(xué)研究所）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液和細(xì)胞ROS 檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），其他分析純?cè)噭ū本┰噭S）。多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞采用含10% FBS、1% 青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接種后孵育24 h。采用含 40% FBS、10%DMSO 的高糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行凍存。

1.3 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率孵育結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在 37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)1.5 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)孔A 值－空白孔A 值）/（對(duì)照孔A 值－ 空白孔A 值）×100%。

1.4 細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)將HepG2 細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組和損傷組，每組設(shè)3 個(gè)平行孔。對(duì)照組和損傷組于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞懸液，每孔90 μL，接種密度為每孔5×103個(gè)細(xì)胞，空白組加入相同體積培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。空白組和對(duì)照組加培養(yǎng)基，每孔10 μL，損傷組分別加入10 μL 終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和1.0 mmol·L－1的H2O2，孵育2 h 。參照“1.3”中的方法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)HepG2 細(xì)胞分為對(duì)照組和人參皂苷RH1、F1、RD、RO 和RE 組，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。對(duì)照組和人參皂苷組于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞懸液，每孔90 μL，接種密度為每孔5 ×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。人參皂苷組分別加入終濃度為10、20 和40 μmol·L-1的人參皂苷RH1、F1、RD、RO 和RE，每孔10 μL，對(duì)照組加培養(yǎng)基，每孔10 μL，孵育3 h。參照“1.3”中的方法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)HepG2 細(xì)胞分為對(duì)照組、損傷組和人參皂苷保護(hù)組，每組設(shè)6 個(gè)平行孔。接種細(xì)胞懸液，每孔80 μL，接種密度為每孔5 ×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。人參皂苷保護(hù)組加入10、20 和40 μmol·L-1的人參皂苷RH1、F1、RD、RO和RE，每孔10 μL，對(duì)照組和損傷組加入相同體積的DMEM 空白培養(yǎng)基，孵育3 h。損傷組和人參皂苷保護(hù)組加入由“1.4”細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)篩選出的達(dá)半數(shù)抑制濃度（IC50）時(shí)的H2O2，每孔10 μL，對(duì)照組加入相同體積的DMEM 空白培養(yǎng)基，孵育2 h。參照“1.3”中的方法測(cè)定各組細(xì)胞存活率。

1.7 CAA 法測(cè)定細(xì)胞抗氧化能力HepG2 細(xì)胞分為設(shè)空白組、對(duì)照組和人參皂苷保護(hù)組，每組設(shè)3 個(gè)平行孔。接種細(xì)胞懸液，每孔100μL，接種密度為每孔5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，人參皂苷保護(hù)組分別加入100 μL 含有不同濃度人參皂苷（1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 μmol·L－1）和25 μmol·L－1DCFH-DA 溶液的培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組加入100μL僅含有25 μmol·L－12'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA）的溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)1 h 去除DCFH-DA，用PBS洗滌1次。對(duì)照組和人參皂苷保護(hù)組加入100 μL 含有600 μmol·L－1AAPH的HBSS 溶液處理，空白組加入100 μL 的HBSS 溶液，最后用熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長為485/20，發(fā)射波長為528/20）每5 min 測(cè)定一次熒光值，持續(xù)1 h。CAA unit=1－（∫SA/∫CA）。其中∫SA 表示樣品曲線累積面積，∫CA 表示對(duì)照組曲線累積面積。

1.8 DCFH-DA 探針法測(cè)定細(xì)胞中ROS水平HepG2 細(xì)胞分為對(duì)照組、損傷組、人參皂苷對(duì)照組和人參皂苷保護(hù)組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，將HepG2 細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，接種密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。人參皂苷對(duì)照組和人參皂苷保護(hù)組加入10、20 和40 μmol·L－1的人參皂苷，每孔250 μL，損傷組和對(duì)照組補(bǔ)充相同體積的DMEM 空白培養(yǎng)基，孵育3 h。損傷組和人參皂苷保護(hù)組加入由“1.4”細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)篩選出的達(dá)IC50時(shí)濃度的H2O2，每孔250 μL，對(duì)照組和人參皂苷對(duì)照組加入相同體積的DMEM 空白培養(yǎng)基，孵育2 h，孵育結(jié)束后移除培養(yǎng)基，PBS 緩沖液清洗2 次，按照ROS 檢測(cè)試劑盒的說明書步驟進(jìn)行后續(xù)操作，最后置于激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。以各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度代表ROS水平。

1.9 WST-1 法測(cè)定細(xì)胞中SOD 活性細(xì)胞接種、分組及給藥處理方法參照“1.8”。孵育完成后移除培養(yǎng)基，加入含PMSF 的RIPA 裂解液，每孔100 μL，冰浴裂解10 min，裂解液4℃、12 000 r·min－1離心10 min，收集上清采用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白水平，并根據(jù)SOD 檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)SOD 活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、ROS 水平和SOD 活性均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2損傷后HepG2 細(xì)胞存活率采用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和1.0 mmol·L－1的H2O2處理HepG2 細(xì)胞后，在H2O2濃度為0.4mmol·L－1時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率為（49.10±3.66）%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度H2O2損傷后HepG2 細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of HepG2 cells after injured by different concentrations of H2O2

2.2 人參皂苷預(yù)處理后各組HepG2 細(xì)胞存活率與H2O2損傷組比較，10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷RH1、F1 及RD 保護(hù)組、20 和40 μmol·L－1人參皂苷RE 保護(hù)組以及40 μmol·L－1人參皂苷RO 保護(hù)組HepG2 細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.05）。其中，10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 保護(hù)組HepG2細(xì)胞存活率升高最為明顯，細(xì)胞存活率分別為（56.70±3.01）%、（61.49±3.15）%和（69.56±4.36）%。見表1。

2.3 細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)中人參皂苷處理后各組HepG2細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，10、20和40 μmol·L－1人參皂苷RH1、F1、RD、RO 及RE 對(duì)照組HepG2細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 人參皂苷F1處理后各組HepG2 細(xì)胞的抗氧化能力與對(duì)照組比較，隨著人參皂苷濃度（1.25、2.50、5.00、10.00 和20.00 μmol·L－1）增加，熒光強(qiáng)度逐漸減小，并呈濃度依賴性降低，表明人參皂苷F1 能有效提高HepG2 細(xì)胞的抗氧化能力（P＜0.05）。見圖2。

人參皂苷的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）由劑量-反應(yīng)曲線和中效原理計(jì)算結(jié)果。見圖3和圖4。CAA 值由EC50值轉(zhuǎn)化而來，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算CAA 當(dāng)量，以μmol·L－1TE（Trolox 當(dāng)量）/ μmol·L－1樣品表示，且EC50越小，CAA 值越大，表示抗氧化效果越好。人參皂苷F1 的EC50為（15.82±0.82）μmol·L－1，Trolox EC50值為（201.73±0.28）μmol·L－1；人參皂苷F1 的CAA當(dāng)量為（1 275.20±33.90）μmol TE/100 μmol·L－1人參皂苷F1。

表1 人參皂苷預(yù)處理后各組HepG2 細(xì)胞存活率Tab.1 Survival rates of HepG2 cells after ginsenoside pretreatment in various groups（n=6，，η/%）

表1 人參皂苷預(yù)處理后各組HepG2 細(xì)胞存活率Tab.1 Survival rates of HepG2 cells after ginsenoside pretreatment in various groups（n=6，，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01vsinjury group.

2.5 人參皂苷F1 處理后各組HepG2 細(xì)胞中ROS 水平與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸減弱。與損傷組比較，10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 保護(hù)組細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸減弱。與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞中ROS水平明顯升高（P＜0.05），10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 對(duì)照組細(xì)胞中ROS水平明顯降低（P＜0.05）；與損傷組比較，10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 保護(hù)組細(xì)胞中ROS 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖5和表3。

表2 細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)中人參皂苷處理后各組HepG2 細(xì)胞存活率Tab.2 Survival rates of HepG2 cells after treated with ginsenoside in cell protection experiment in various groups（n=6，，η/%）

表2 細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)中人參皂苷處理后各組HepG2 細(xì)胞存活率Tab.2 Survival rates of HepG2 cells after treated with ginsenoside in cell protection experiment in various groups（n=6，，η/%）

圖2 人參皂苷F1 作用后各組HepG2 細(xì)胞中AAPH 誘導(dǎo)DCFH 氧化的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curves of DCFH oxidation induced by AAPH in HepG2 cells after treated with ginsenoside F1 in various groups

圖3 人參皂苷F1 作用后各組HepG2 細(xì)胞中AAPH 誘導(dǎo)DCFH 氧化的劑量-反應(yīng)曲線Fig.3 Dose-effect curve of DCFH oxidation induced by AAPH in HepG2 cells after treated with ginsenoside F1 in various groups

2.6 人參皂苷F1處理后各組HepG2細(xì)胞中SOD 活性與對(duì)照組（98.89±3.57）比較，損傷組HepG2 細(xì)胞中SOD 活性（42.99±2.38）明顯降低（P＜0.05），10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 對(duì)照組HepG2 細(xì)胞中SOD 活性（109.81±1.68、117.79±0.28 和127.19±1.49）明顯升高（P＜0.05）。與損傷組比較，10、20 和40 μmol·L－1人參皂苷F1 保護(hù)組HepG2 細(xì)胞中SOD 活性（51.13±3.35、57.16±2.12 和73.90±3.40）明顯升高（P＜0.05）。

3 討論

人參皂苷在濃度較高時(shí)往往對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出促凋亡作用，多用于抑制細(xì)胞增殖等方面的研究，在以往人參皂苷抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究中，研究者多選擇40 μmol·L－1以下的濃度作為處理濃度［8-9］。本研究結(jié)果顯示：人參皂苷RH1、F1、RD、RO 和RE 預(yù)處理的HepG2 細(xì)胞在受到H2O2氧化損傷時(shí)細(xì)胞存活率均有所升高，其中采用人參皂苷F1 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2 細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)，人參皂苷RO 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2 細(xì)胞保護(hù)作用最小，且人參皂苷RH1、F1、RD、RO 和RE 對(duì)HepG2 細(xì)胞均無增殖和毒性作用，表明該濃度范圍內(nèi)的人參皂苷能夠提高氧化損傷的HepG2 細(xì)胞存活率的原因與其增殖無關(guān)。因此，本研究選用人參皂苷F1 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。人參皂苷F1 是人參皂苷Rg1 水解β-D 葡萄糖苷得到的次級(jí)皂苷［10］。研究［11］表明：原人參皂苷可以通過水解等方式轉(zhuǎn)化為次級(jí)人參皂苷，次級(jí)人參皂苷同樣具有良好的藥理作用。

表3 人參皂苷F1 作用后各組HepG2 細(xì)胞中ROS 水平Tab.3 Levels of ROS in HepG2 cells after treated with ginsenoside F1 in various groups(n＝3，）

表3 人參皂苷F1 作用后各組HepG2 細(xì)胞中ROS 水平Tab.3 Levels of ROS in HepG2 cells after treated with ginsenoside F1 in various groups(n＝3，）

＊P＜0.01vscontrol group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsinjury group.

為進(jìn)一步考察人參皂苷F1 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的HepG2 細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究采用CAA 法檢測(cè)細(xì)胞的抗氧化活性、DCFH-DA 探針法測(cè)定細(xì)胞ROS 水平和WST-1 法水平細(xì)胞SOD活性。CAA 法是由美國康奈爾大學(xué)劉瑞海教授建立的評(píng)價(jià)細(xì)胞抗氧化能力的方法，該方法利用外源性DCFH-DA 探針能夠被HepG2 細(xì)胞內(nèi)的酯酶催化形成DCFH，DCFH 被氧自由基氧化后形成具有熒光的DCF 的特性，根據(jù)細(xì)胞熒光物質(zhì)的量判斷細(xì)胞的抗氧化能力，熒光物質(zhì)越少說明細(xì)胞抗氧化能力越強(qiáng)［12］。本研究CCA 法檢測(cè)結(jié)果顯示：人參皂苷F1 可有效降低HepG2 細(xì)胞熒光強(qiáng)度，且熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性降低，人參皂苷F1 的EC50為（15.82±0.82）μ mol·L－1，CAA 當(dāng)量為（1 275.20±33.90）μmol TE/100 μmol·L－1人參皂苷F1。研究［13］表明：EC50與CAA 值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，EC50越小，CAA 值越大，表明抗氧化物質(zhì)提高細(xì)胞抗氧化能力的作用越強(qiáng)。人體內(nèi)的ROS主要來源于線粒體氧化呼吸鏈［14］。研究［15］表明：人參皂苷Rg1 可以通過改善線粒體功能，調(diào)節(jié)ROS 的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示：人參皂苷F1 預(yù)處理的H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HepG2 細(xì)胞中ROS 水平較氧化損傷的HepG2 細(xì)胞低，與其他研究［16］發(fā)現(xiàn)的人參皂苷F1 通過激活SIRT1、降低ROS 水平、恢復(fù)線粒體功能從而抑制氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷的結(jié)果相符。本研究結(jié)果顯示：人參皂苷F1預(yù)處理的HepG2 細(xì)胞中ROS 水平較對(duì)照組降低。這可能是由于HepG2 細(xì)胞是癌細(xì)胞，與其他正常組織細(xì)胞比較，癌細(xì)胞本身就存在高水平的ROS［17-18］，因此在采用人參皂苷F1 處理后，無論是否用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷，HepG2 細(xì)胞中ROS 水平均呈現(xiàn)下降，表明人參皂苷F1 可以通過抑制ROS 產(chǎn)生和累積從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。人體本身存在抗氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用主要是依賴以SOD 為首的一系列抗氧化酶的酶促反應(yīng)作用［19］。本研究結(jié)果顯示：氧化損傷的HepG2細(xì)胞中SOD 活性明顯下降，可能是由于利用H2O2誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞中SOD 短時(shí)間內(nèi)大量消耗，得不到及時(shí)補(bǔ)充；人參皂苷F1 預(yù)處理的氧化損傷的HepG2 細(xì)胞中SOD 活性相對(duì)升高，表明在氧化應(yīng)激條件下，人參皂苷F1 可能是通過升高SOD 活性加快過量ROS 的清除速度從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。研究［20-23］表明：人參皂苷F1 的前體Rg1、人參皂苷Rh2 和Rg2 可以通過升高SOD 等一系列抗氧化酶的活性，起到對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，不同的人參皂苷對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用存在一定差別，其中人參皂苷F1 通過降低ROS 水平和升高SOD 活性對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化損傷起到一定的保護(hù)作用。本研究結(jié)果為后續(xù)人參皂苷F1 抗細(xì)胞氧化應(yīng)激的信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。