超聲波輔助堿液提取核桃分心木黃酮及其抗氧化活性的研究

沙玉歡，習(xí) 俞，朱增芳，吳慶智，毛曉英

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus），簡稱分心木，又名核桃內(nèi)隔膜，是胡桃科核桃屬植物果核內(nèi)部的木質(zhì)隔膜，呈彎曲的薄片狀，且質(zhì)地脆，一般是核桃總質(zhì)量的5%左右，是新疆傳統(tǒng)維吾爾族藥物之一，具有利尿清熱、健脾固腎、澀精等作用[1]。現(xiàn)在的人們通常會將分心木用水煮沸后飲用，治療腎虛、遺精等。長期喝分心木水泡物，還可以緩解老年人的腰酸腿疼，改善睡眠質(zhì)量，提高身體免疫力[2-3]。核桃分心木中含有豐富的活性成分，包括有機酸、酚類、黃酮、生物堿、油脂、皂苷、揮發(fā)油、糖類、氨基酸、鞣質(zhì)、多肽和其他化合物[4-5]。

大量研究結(jié)果表明分心木中有大量的黃酮類物質(zhì)[1，4]。黃酮類物質(zhì)又稱為類黃酮物質(zhì)，是以α -苯基苯并吡喃酮為主體的一系列物質(zhì)的總稱，在治療疾病和食品添加劑方面的應(yīng)用較為廣泛。它不僅可以清除人體內(nèi)的游離自由基，還可抑制各種自由基的產(chǎn)生，起到延緩衰老、預(yù)防心腦血管疾病和癌癥等作用[6-7]。目前黃酮的提取方法主要有有機溶劑提取法[8]、微波輔助提取法[9]、堿提酸沉法[10]、超聲波輔助提取法[11]、超臨界提取方法[7]等。其中堿液提取核桃分心木黃酮具有安全、方便的特點，然而傳統(tǒng)的堿液提取分心木中黃酮得率較低，因此利用堿溶液在超聲波輔助下提取核桃分心木中總黃酮類物質(zhì)，先進行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面[10-11]優(yōu)化獲得最佳工藝參數(shù)[12]，并對粗提物抗氧化能力進行初步探索，為核桃分心木黃酮的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃分心木，購于石河子農(nóng)貿(mào)市場；蘆丁標準品，北京索萊寶科技有限公司提供；無水乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、FeSO4、鄰菲啰啉、DPPH、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鄰苯三酚、鹽酸、菲洛嗪、FeCl2，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XB-220A 型普利賽斯電子天平，普利賽斯國際貿(mào)易（上海） 有限責(zé)任公司產(chǎn)品；752 型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；DK-8D 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司產(chǎn)品；Heraeus Multifuge X1R 型臺式冷凍離心機，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司產(chǎn)品；DFT-100 型手提式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產(chǎn)品；KQ-200VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗機、標準分析篩，新鄉(xiāng)市雷蒙特機械有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 分心木的預(yù)處理

將分心木置于烘箱中45 ℃條件下干燥12 h，用DFT-100 型粉碎機粉碎，并用80 目篩過篩，置于密封袋中備用。

1.3.2 標準曲線的制備

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13]獲得標準曲線。具體方法：準確稱量10 mg 蘆丁標準品于50 mL 容量瓶，用60%乙醇定容，得到質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL蘆丁標準液。向10 mL 容量瓶中分別吸取蘆丁標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，得到質(zhì)量濃度分別為0，0.01，0.02，0.03，004，0.05 mg/mL 的蘆丁標準溶液。分別加入0.3 mL NaNO2溶液（質(zhì)量分數(shù)為5%），室溫下反應(yīng)6 min，再加入0.3 mL Al(NO3)3溶液（10%），繼續(xù)反應(yīng)6 min，最后加入4 mL NaOH 溶液（4%），用30% 乙醇定容，室溫下等待15 min，搖勻，測定波長507 nm 處吸光度。以吸光度（A） 為縱坐標，蘆丁溶液質(zhì)量濃度（C） 為橫坐標，繪制蘆丁溶液的標準曲線。

1.3.3 分心木總黃酮的測定

提取液于50 mL 容量瓶中以50%乙醇定容。分別取樣品液0.1 mL，按照1.3.2 方法進行反應(yīng)。于波長507 nm 處測吸光度。由標準曲線的擬合方程得到黃酮物質(zhì)的質(zhì)量濃度。黃酮得率計算公式如下：

式中：C ——提取液中黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——樣品提取液定容體積，mL；

V2——測量時量取提取液的定容總體積，mL；

V3——測定用的樣液體積，mL；

m——分心木質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

（1） 堿液濃度的選擇。準確稱取1 g 樣品于50 mL離心管中，在料液比1∶30，超聲提取1 h，超聲頻率140 Hz 的條件下，堿液濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L 時，研究堿液濃度對分心木黃酮得率的影響。

（2） 料液比的選擇。準確稱取1 g 樣品與50 mL離心管中，在提取溫度45 ℃，超聲頻率140 Hz，堿液濃度0.3 mol/L，超聲提取1 h 條件下，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 時，研究料液比對分心木黃酮得率的影響。

（3） 超聲時間的選擇。準確稱取1 g 樣品與50 mL離心管中，在料液比1∶30，提取溫度45 ℃，堿液濃度0.3 mol/L，超聲頻率140 Hz 下，超聲提取時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h 時，研究超聲時間對分心木黃酮得率的影響。

（4） 超聲功率的選擇。準確稱取1 g 樣品與50 mL離心管中，在料液比為1∶30，堿液濃度0.3 mol/L，提取溫度45 ℃，超聲提取1 h 條件下，超聲頻率分別為120，140，160，180，200 Hz 時，研究超聲功率對分心木黃酮得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，運用Design Expert 8.0.6 設(shè)計響應(yīng)面試驗，分析了各因素之間的交互作用及對核桃分心木總黃酮得率的影響大小。對超聲功率、料液比、超聲時間進行三因素三水平的試驗設(shè)計。以黃酮得率為響應(yīng)值，獲得最佳提取工藝及參數(shù)。

響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計

1.4 抗氧化能力的測定

1.4.1 粗提物樣品預(yù)處理

粗提物稱取0.1 g 用20%乙醇溶液溶解并用濾紙過濾，于100 mL 容量瓶定容，配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 溶液，并將樣品稀釋200 倍進行抗氧化能力測定，粗黃酮純度為2.776%。

1.4.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參照Cheng Z 等人[14]的方法，略有改動。以維C為陽性對照。DPPH 用無水乙醇超聲溶解，配置成一定質(zhì)量濃度（波長517 nm 處吸光度為0.4～0.8）。4 mL DPPH 溶液中加入4 mL 樣品液的吸光度記為A1，4 mL無水醇溶液中加4 mL 樣品液的吸光度記為A2，4 mL DPPH 溶液中加入4 mL 無水乙醇溶液的吸光度記為A。按公式（2） 計算。

式中：C——DPPH 自由基基清除率，%；

1.4.3 羥自由基清除率的測定

采用鄰二氮菲-Fe2+法測定羥自由基清除率[15]。向試管中加入0.75 mmol/L 鄰菲羅啉和pH 值7.4 的PBS 緩沖液1.5 mL，充分混勻后加入濃度為0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，再向試管中加入粗提物溶液1 mL混勻置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后于波長536 nm 處測定各管的吸光度[16]記為A1；其中，陰性對照試驗用1 mL 蒸餾水代替樣品溶液，再加入質(zhì)量分數(shù)為0.01%的過氧化氫溶液反應(yīng)30 min 測定吸光度記為A0；正常試驗用1 mL 的蒸餾水代替過氧化氫溶液，測定吸光度記為A2。樣品試驗為1 mL樣品溶液同質(zhì)量濃度的維C 作陽性對照。按公式（3） 計算。

1.4.4 超氧陰離子自由基的測定

采用鄰苯三酚法[17]測定超氧陰離子自由基清除率。取5 mL pH 值8.2 的磷酸鹽緩沖溶液與1 mL 樣品溶液混合，室溫反應(yīng)15 min（25 ℃），然后加入45 mmoL/L 的鄰苯三酚0.2 mL，搖勻，反應(yīng)4 min，用一滴10 mol/L 的鹽酸終止反應(yīng)。于波長325 nm 處測定吸光度，記為A1；0.2 mL 的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測定的吸光度記為A2；用1 mL 溶劑代替樣品溶液測定吸光度，記為A3，平行3 次，同質(zhì)量濃度的維C 作陽性對照。按公式（4） 計算。

1.4.5 ABTS 自由基清除能力測定

采用黃尚榮等人[18]的方法，略有改動。配置7 mmol/L ABTS 溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液，將ABTS 溶液與過硫酸鉀溶液按1∶0.5 比例在錐形瓶中混勻，于室溫并且避光反應(yīng)12 h，使其產(chǎn)生ABTS 自由基。使用前將ABTS 自由基溶液用無水乙醇稀釋至734 nm 處的吸光度為（0.700±0.020）。取1 mL 樣品再加入4 mL 稀釋的ABTS 自由基溶液，30 ℃條件下反應(yīng)6 min 后于波長734 nm 處測定吸光度，記為A1。1 mL 無水乙醇代替樣品溶液，吸光度記為A0。重復(fù)3 次，同質(zhì)量濃度的維C 作陽性對照。按公式（5） 計算。

1.4.6 鐵離子螯和能力的測定

參考鄭義等人[19]的方法進行測定。取1 mL 的樣品溶液于10 mL 試管中，加3.7 mL 蒸餾水，再加入2 mmoL/L 的FeCl2溶液0.1 mL 和5 mmoL/L 的菲洛嗪溶液0.2 mL。于25 ℃下水浴10 min，于波長562 nm處測吸光度，A0是以1 mL 的蒸餾水代替樣品溶液反應(yīng)后的吸光度，A1是樣品溶液反應(yīng)后的吸光度，A2是用0.1 mL 的蒸餾水代替FeCl2溶液反應(yīng)后的吸光度。以同質(zhì)量濃度的EDTA 作陽性對照。按公式（6） 計算。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin7.5 繪圖，SPSS25.0 進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，Design Expert 8.0.6 軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的確定

根據(jù)標準曲線得到擬合方程為：

蘆丁標準曲線見圖1。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 堿液濃度的選擇

堿液濃度對黃酮得率的影響見圖2。

由圖2 可知，隨著堿液濃度的升高黃酮含量先升高后降低，當(dāng)堿液濃度達到0.3 mol/L 時，黃酮得率達到最大值。黃酮得率升高的原因可能與黃酮類化合物分子中酚羥基有關(guān)，堿溶液增加了溶劑的極性，比較用酸溶液和堿溶液作為溶劑提取黃酮時，堿溶液提取黃酮得率明顯比酸溶液高，且隨著NaOH溶液濃度的增加，黃酮得率增加，較高的堿液濃度導(dǎo)致黃酮物質(zhì)的母核破壞。同時，堿溶性雜質(zhì)也隨著溫度和堿濃度的升高而溶出，堿溶性雜質(zhì)與黃酮類物質(zhì)競爭溶出[20]，從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的得率下降。因此，選擇濃度為0.3 mol/L 的稀堿溶液作為浸提溶劑。

2.2.2 料液比的選擇

料液比對黃酮得率的影響見圖3。

圖1 蘆丁標準曲線

圖2 堿液濃度對黃酮得率的影響

圖3 料液比對黃酮得率的影響

由圖3 可知，隨著料液比的增加黃酮得率不斷升高，隨著溶劑的增加，溶液與核桃分心木粉末接觸面積增加，溶劑與溶質(zhì)接觸充分，黃酮物質(zhì)源源不斷地析出，導(dǎo)致黃酮得率不斷升高；當(dāng)料液比繼續(xù)增加，黃酮得率雖然有所增加，但不顯著，反而大大增加了黃酮物質(zhì)提取的成本。因此，選擇最佳的料液比為1∶30。

2.2.3 超聲時間的選擇

超聲時間對黃酮得率的影響見圖4。

由圖4 可知，黃酮提取率先急劇升高后得率趨于平緩。原因可能是隨著超聲時間的增加，溫度也會隨之升高，減弱溶質(zhì)和溶液之間的相互作用力，溶質(zhì)更容易溶解到溶劑中[21]。因此，選擇最佳的提取時間為1.5 h。

2.2.4 超聲功率的選擇

超聲功率對黃酮得率的影響見圖5。

圖4 超聲時間對黃酮得率的影響

圖5 超聲功率對黃酮得率的影響

由圖5 可知，隨著超聲功率的增加黃酮得率先緩慢增加然后急劇下降，這可能由于隨著超聲功率的增加，溫度升高，加快黃酮物質(zhì)的溶出，另一方面，由于超聲波釋放能量會產(chǎn)生大量氣泡。氣泡爆裂使周圍組織乳化甚至破裂，這一生物學(xué)效應(yīng)稱為“空穴效應(yīng)”。分心木中的黃酮物質(zhì)大部分存在于細胞內(nèi)或者細胞膜表面，隨著超聲功率的增加“空穴效應(yīng)”導(dǎo)致界面擴散層上的分子擴散速度加快并且破壞細胞組織，使黃酮加速溶出。而后黃酮得率急劇下降，過高的功率容易導(dǎo)致黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞或者導(dǎo)致固體材料中的雜質(zhì)溶出，從而降低了黃酮得率[22]。因此，最佳超聲功率選為140 W。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案見表2。

2.3.2 響應(yīng)面的建立與分析

經(jīng)多元回歸擬合和方差分析，得回歸方程：

由表3 分析結(jié)果可知，該回歸方程p＜0.001，說明該模型極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，由Design Expert 8.0.6 軟件可得模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.943 1，矯正系數(shù)R2Adj=0.869 9＞0.8，表明此該模型擬合度良好。因此，可用此模型進行分心木中黃酮得率的分析和預(yù)測是合理的。試驗結(jié)果的預(yù)測和分析能用該回歸方程來替代真實試驗點分析由3 個因素A，B，C 得出的F 值判斷，各因素對分心木中黃酮提取的影響順率序為超聲時間＞料液比＞堿液濃度。交互項AB，AC，BC 的p＜0.05，表明堿液濃度和超聲時間、堿液濃度和料液比、超聲時間和料液比之間有交互作用且對分心木中的黃酮類物質(zhì)的得率影響顯著。

方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案

表3 方差分析

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)曲面越陡峭，表明2 個因素對總黃酮得率的影響越大，反之，曲面越平緩表明2 個因素對總黃酮得率的影響越小。等高線圖呈現(xiàn)橢圓，表明交互性良好。

超聲時間與堿液濃度對黃酮得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖6。

圖6 超聲時間與堿液濃度對黃酮得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

由圖6 可知，響應(yīng)曲面圖曲面陡峭，對總黃酮提取率的影響極顯著，等高線圖呈橢圓，說明超聲時間和堿液濃度交互性良好。

料液比和超聲時間對黃酮得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖7，料液比和堿液濃度對黃酮得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖8。

由圖7 和圖8 可以明顯地看到曲面較陡峭，反映出兩因素對黃酮的得率的影響顯著，交互性良好。另外，3 個響應(yīng)面圖呈現(xiàn)凸狀，開口朝下，有最高點，且從最高點向四周邊緣均勻下降，這表明各因素作用增大時，響應(yīng)面值也增大，達到最高點后，各因素作用增大，響應(yīng)面值反而會減小[23]。

2.3.4 驗證試驗

利用Design Expert 8.0.6 軟件分析得到的回歸模型的方程為Y=13.41+0.39A+1.73B+0.59C+2.33AB+2.00AC-1.71BC-1.88A2-2.89B2-0.93C2，得到最佳提取工藝參數(shù)為堿液濃度0.39 mol/L，超聲時間1.25 h，料液比1∶36.78，最佳提取條件下的分心木中黃酮類物質(zhì)的預(yù)測得率為14.05%。為了驗證設(shè)計試驗結(jié)果，也為了操作的簡便可行，采取堿液濃度0.4 mol/L，超聲時間1.5 h（90 min），料液比1∶37 作為最佳條件，在此基礎(chǔ)上做3 次平行試驗，可得分心木中黃酮得率均值為13.95%。實際所得的平均得率與預(yù)測值差值為0.71%，說明該模型對分心木總黃酮提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化是可靠的。

圖7 料液比和堿液濃度對黃酮得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 料液比和超聲時間對黃酮得率交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

2.4 粗提取物抗氧化能力的研究

抗氧化能力測定結(jié)果見表4。

表4 抗氧化能力測定結(jié)果/ %

由表4 可知，除了鐵離子螯和能力，核桃分心木黃酮粗提物的其他抗氧化指標都高于維C 陽性對照，尤其DPPH 自由基清除率和羥自由基清除率，其中DPPH 自由基清除率高出43.54%，而羥自由基清除率高出50%。堿液提取的粗黃酮物質(zhì)中可能含有各種多糖物質(zhì)，還有其他小分子物質(zhì)和多種黃酮類物質(zhì)共同作用導(dǎo)致抗氧化能力提高，高于單一組分的維C陽性對照物。結(jié)果表明，核桃分心木黃酮具備天然抗氧化劑的應(yīng)用潛質(zhì)，黃酮物質(zhì)與多糖組分或者黃酮物質(zhì)之間相互作用，導(dǎo)致粗提物抗氧化能力比單一組分的陽性對照物的抗氧化能力高。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析軟件設(shè)計了三因素三水平試驗，并進行回歸分析得到分心木黃酮得率的最佳提取工藝及參數(shù)。最佳參數(shù)為堿液濃度0.4 mol/L，超聲時間1.5 h，料液比1∶37，得分心木中黃酮得率均值為13.95%±2.163%。由抗氧化能力的測定結(jié)果可知，除了鐵離子螯和能力粗提物的其他抗氧化指標顯著高于維C 陽性對照，尤其DPPH 自由基清除率和羥自由基清除率，其中DPPH 自由基清除率高出43.54%，羥自由基清除率比同等質(zhì)量濃度的陽性對照物高出50%。原因可能與粗提物中的多糖組分或者幾種黃酮類物質(zhì)之間的相互作用有關(guān)，導(dǎo)致抗氧化能力的提高。研究結(jié)果表明，核桃分心木是黃酮提取的理想材料，且黃酮粗提物具有很高的抗氧化能力，研究為核桃副產(chǎn)物的精深加工提供一定的理論基礎(chǔ)。