促紅細胞生成素對慢性腦缺血大鼠腦組織促凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

嚴 澎，楊 斌，李文波，何玉清，阮春云

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)又稱紅細胞因子與促紅素，為人體內(nèi)源性的糖蛋白激素，主要通過與其受體結(jié)合起作用，具有刺激紅細胞生成的功能[1]。既往研究顯示EPO不僅在胎兒的肝臟、成年人的腎臟中表達，也在非造血系統(tǒng)表達，如神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞以及膠質(zhì)細胞。近年來，研究顯示EPO與腦缺血疾病的進展有關(guān)，早期運用外源性的EPO對缺氧缺血性新生大鼠的腦損傷有神經(jīng)保護作用[2]。本研究通過雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法建立慢性腦缺血大鼠模型，探討EPO對慢性腦缺血大鼠腦組織凋亡與促凋亡蛋白表達水平的影響，為臨床治療慢性腦缺血病人的藥物設(shè)計提供動物實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 兔抗鼠Caspase-3抗體(上海優(yōu)寧維公司生物科技有限公司)，兔抗鼠Bax抗體(上海優(yōu)予生物科技有限公司)，兔抗鼠Bcl-2抗體(上海恒斐生物科技有限公司)，小鼠抗人Omi/HtrA2抗體(艾美捷科技有限公司)，ECL試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定(TUNEL)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)，過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒(上海研謹生物科技有限公司)，EPO(Theramabs)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma)。冷凍離心機3K15(Sigma)，正置熒光顯微鏡FM-51D(上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器有限公司)，全自動輪盤式切片機(LEICA)。

1.2 實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性16～20周齡SD大鼠96只，體重250～300 g，購于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物實驗中心，許可證號：SYXK(鄂)2015-0025，購回飼養(yǎng)1周，再用于后續(xù)實驗，飼養(yǎng)溫度維持在20～25 ℃，空氣濕度為50%～55%，光照為人工光照，晝12 h、夜12 h，所有大鼠全天飲水自由。

1.3 模型制備與動物分組處理 采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法建立慢性腦缺血大鼠模型，選取24只SD大鼠，隨機分為對照組與假手術(shù)組，每組12只，再選取30只SD大鼠作為建模組，用于建立慢性腦缺血模型。建模組大鼠于建模前12 h禁食，腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉，頸部正中進行縱向切口，玻璃分針分離雙側(cè)頸總動脈，雙線結(jié)扎，電刀切斷頸總動脈防止復(fù)流，碘伏消毒，縫合切口，腹腔注射1×105U青霉素，防止感染，術(shù)后24 h內(nèi)蘇醒大鼠納入研究，未蘇醒大鼠剔除，本研究共剔除6只大鼠，剩余大鼠隨機均分為模型組與EPO組，每組12只。假手術(shù)組大鼠除不進行結(jié)扎血管，剩余操作與建模組大鼠相同，對照組不做任何處理。

造模成功0.5 h后，EPO組大鼠腹腔注射EPO 5 U/(g·d)，連續(xù)注射2周，模型組、假手術(shù)組大鼠腹腔注射同體積的生理鹽水，對照組大鼠不予任何處理。連續(xù)給藥結(jié)束后，每組大鼠一部分用于神經(jīng)功能評分、學(xué)習(xí)記憶能力測試，剩余大鼠用于其他實驗指標(biāo)檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能評分 采用Longa 5級評分法評估藥物干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能評分：無神經(jīng)缺損癥狀計0分；不能伸展右側(cè)前爪計1分；行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈計2分；行走時向右側(cè)傾倒計3分；不能自發(fā)行走，意識喪失計4分。

1.4.2 Morris水迷宮實驗測定逃避潛伏期與空間記憶能力 每組隨機選取6只SD大鼠用于Morris水迷宮實驗，該實驗包括隱蔽平臺實驗與空間探索實驗。隱蔽平臺實驗每只SD大鼠訓(xùn)練量為每日3次，共5 d，觀察并記錄每只SD大鼠到達平臺時間(逃避潛伏期)，訓(xùn)練3次的平均值作為該天的成績；隱蔽平臺實驗訓(xùn)練5 d后，撤去平臺，觀察并記錄每只SD大鼠在120 s內(nèi)穿過平臺次數(shù)，用于檢測大鼠的空間記憶能力。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 末次給藥1 h后，采用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取出完整的腦組織，一部分用于腦勻漿制備，2 000 r/min、10 min，取上清液存儲于-80 ℃環(huán)境中，采用ELISA法檢測大鼠腦組織中的MDA含量及SOD、CAT、GSH活性，操作嚴格參照試劑盒說明進行。剩余腦組織一部分保存于-80 ℃環(huán)境中用于蛋白水平檢測，另一部分固定于4%多聚甲醛用于蘇木精-伊紅(HE)染色與TUNEL檢測。

1.4.4 HE染色與TUNEL檢測 處死大鼠，將腦組織置于4%多聚甲醛中固定，進行常規(guī)石蠟包埋，一部分用于HE染色，另一部分根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作用于TUNEL檢測，在顯微鏡下觀察并采集圖像。在TUNEL法檢測過程中，隨機選取10個視野，記錄100個細胞中陽性細胞數(shù)，統(tǒng)計各組細胞凋亡率，細胞凋亡率=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.4.5 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測 提取各組大鼠腦組織總蛋白，采用Bradford調(diào)整蛋白濃度相同，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，密封2 h，加入兔抗鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2、β-actin一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，再用TBST緩沖液漂洗40 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，參照ECL試劑盒操作說明觀察膜上蛋白條帶，收集影像。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評分、逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較 與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能評分增加(P<0.05)；與模型組相比，EPO組神經(jīng)功能評分降低(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期延長(P<0.05)，120 s穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與模型組相比，EPO組逃避潛伏期縮短(P<0.05)，120 s穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分、逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較 (±s)

2.2 各組大鼠腦組織SOD、CAT、GSH及MDA含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中SOD、CAT、GSH水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組相比，EPO組腦組織中SOD、CAT、GSH水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織SOD、CAT、GSH及MDA含量比較 (±s)

2.3 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況比較 對照組與假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、排列整齊、細胞核大且圓；模型組大鼠腦組織中神經(jīng)元排列紊亂、核固縮、細胞體積減小且形狀不規(guī)則；EPO組大鼠腦組織中神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組改善較多，細胞排列整齊，細胞核固縮較少。詳見圖1。對照組與假手術(shù)組大鼠腦組織TUNEL染色陽性細胞較少，其次為EPO組、模型組。詳見圖2。模型組大鼠腦組織細胞凋亡率高于對照組、假手術(shù)組及EPO組(P<0.05)，對照組與假手術(shù)組大鼠腦組織細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠腦組織TUNEL檢測結(jié)果

表3 各組大鼠腦組織細胞凋亡率比較 (±s) 單位：%

2.4 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2、Bcl-2蛋白水平比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中的Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯下降(P<0.05)，對照組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，EPO組大鼠腦組織中的Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白凝膠成像結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白水平比較 (±s)

3 討 論

腦缺血是由多種因素引起的腦供血不足所致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，慢性腦缺血是其中常見的病理狀態(tài)之一，常伴發(fā)于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病進程中，如腦供血不足、皮質(zhì)下動脈硬化性腦病、缺血導(dǎo)致的腦白質(zhì)損害以及腦萎縮等[3]。EPO屬于造血細胞因子超家族成員，為含有唾液酸的酸性糖蛋白，主要由蛋白質(zhì)、糖類組成，有4個糖基化位點。EPO與其受體(EPOR)結(jié)合后使其構(gòu)象發(fā)生變化，能夠使JAK2絡(luò)氨酸激酶激活，使EPOR的多個絡(luò)氨酸殘基磷酸化，激活下游多個信號通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶、有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及Janus激酶2(JAK2)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子等[4]。臨床研究顯示，EPO在開顱動脈瘤夾閉術(shù)后腦缺血治療中效果顯著，能夠幫助病人術(shù)后缺血腦組織微循環(huán)重建，改善腦缺血病人臨床癥狀，并對神經(jīng)功能有保護作用[5]。本研究通過雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法建立慢性腦缺血大鼠模型以模擬成年人慢性腦缺血癥狀，并用EPO進行處理，結(jié)果顯示，EPO可以降低慢性腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能評分，還可以提高大鼠的記憶能力。臨床研究顯示，在高壓氧治療的基礎(chǔ)上增加EPO治療能夠改善缺氧缺血性腦病患兒神經(jīng)行為，改善腦組織的代謝，并且安全性高[6]。本研究結(jié)果提示EPO對慢性腦缺血大鼠神經(jīng)功能有保護作用。

氧化應(yīng)激在神經(jīng)、血管性疾病中發(fā)揮著重要作用，慢性腦缺血存在慢性低灌注的特點，在此過程中細胞中的線粒體損傷，從而引起組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧物質(zhì)產(chǎn)生，脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，對機體的血腦屏障功能與腦實質(zhì)造成損傷[7]。同時在機體慢性缺血時，會抑制海馬突觸的可塑性、沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)活性，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)以及認知受損過程[8]。本研究結(jié)果顯示，EPO可以降低慢性腦缺血大鼠腦組織中MDA含量，增加SOD、CAT、GSH水平。MDA是過氧化產(chǎn)物的主要成分之一，過量的自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會增加神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)損傷程度，導(dǎo)致腦組織損傷程度加重；SOD具有清除自由基的能力[9-10]；CAT主要是催化過氧化氫分解成為水和氧；GSH由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，具有抗氧化以及解毒作用。SOD、CAT、GSH共同組成了機體抗氧化的防御系統(tǒng)，其活性均能反映機體的抗氧化應(yīng)激能力。石境懿等[11]研究顯示，重組人促紅細胞生成素(rhEPO)可以降低新生兒缺氧缺血性腦病導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果表明，EPO可以降低慢性腦缺血大鼠腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少神經(jīng)組織損傷。

慢性腦缺血后腦組織會出現(xiàn)損傷，氧化應(yīng)激增強，調(diào)控細胞凋亡的特定蛋白水平表達上調(diào)。細胞核、線粒體是影響細胞凋亡的重要因素，線粒體損傷使活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，影響B(tài)cl、Bax比例，細胞色素C先后與凋亡酶激活因子、Caspase-9結(jié)合，激活Caspase-3，破壞細胞核內(nèi)的DNA修復(fù)酶促進細胞凋亡[12-13]。本研究結(jié)果顯示，EPO可以降低慢性腦缺血大鼠腦組織的細胞凋亡率，還可以降低Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平，增加Bcl-2蛋白含量。Bcl-2是線粒體途徑凋亡通路中的重要成員，其高表達可以抑制多種因素導(dǎo)致的細胞凋亡，而Bax屬于促細胞凋亡基因，兩者比值大小可以直接反映細胞凋亡情況。Omi/HtrA2是新型的促凋亡蛋白，當(dāng)細胞處于正常的生理代謝時，其主要分布于線粒體膜間隙，當(dāng)細胞收到凋亡信號時，會通過自我加工(去N端的殘基)穿過線粒體膜以進入胞質(zhì)，通過與其相關(guān)因子結(jié)合，激活下游的Caspase-3蛋白水平[14]。李晉娜等[15]研究顯示，rhEPO可以促進Bcl-2上調(diào)、Bax下調(diào)，改善慢性缺血大鼠的神經(jīng)細胞凋亡。鄒禮樂等[16]研究顯示，EPO可以通過抑制腦組織Omi/HtrA2表達而減少神經(jīng)細胞凋亡，實現(xiàn)對腦損傷的保護作用。本研究結(jié)果表明，EPO可以通過調(diào)節(jié)Caspase-3、Bax、Bcl-2、Omi/HtrA2蛋白水平抑制慢性腦缺血大鼠腦組織細胞凋亡。

綜上所述，EPO可以降低Caspase-3、Bax、Omi/HtrA2蛋白水平，增加Bcl-2蛋白含量，降低大鼠MDA含量，增加SOD、CAT、GSH活性，降低大鼠腦組織細胞凋亡，增強抗氧化應(yīng)激能力，從而減輕腦組織損傷。本研究只是通過大鼠模型實驗來進行探討，而在臨床上是否存在相似凋亡相關(guān)蛋白水平變化，還需要進一步研究。