尖葉假龍膽通過調控TGF-β1/Smad7信號抑制ISO誘導的大鼠心肌纖維化的研究*

河北中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院

安麗平 孫佳歡 于 琨 安 然 吳江立 劉 玉 李愛英 楊洪霞(石家莊 050200)

提要 目的：研究尖葉假龍膽抑制異丙腎上腺素(ISO)誘導的大鼠心肌纖維化的作用及作用機制。方法：雄性SD大鼠皮下注射ISO(5 mg/kg·d-1)，連續(xù)注射7 d，制備心肌纖維化模型，給予尖葉假龍膽(0.3 mg/kg和0.6 mg/kg)灌胃21 d，采用HE和Masson染色觀察心臟組織形態(tài)學和病理學改變，心電圖觀察心功能改變，免疫組織化學染色分析心臟組織中轉化生長因子β1(TGF-β1)、Smad7蛋白表達變化，酶聯免疫法測定血清C反應蛋白(CRP)、TGF-β1水平，放射免疫法檢測血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)、Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNP)含量。結果：尖葉假龍膽可改善ISO所致的心臟功能和結構紊亂，減少心臟組織膠原纖維沉積，降低心臟組織TGF-β1表達，增加Smad7表達，減少血清TGF-β1水平，降低血清中PⅢNP水平。結論：尖葉假龍膽通過調控TGF-β/Smad7信號通路抑制ISO誘導的大鼠心肌纖維化。

《中國心血管病報告2018》[1]報道指出，心血管疾病(CVD)患病率持續(xù)升高，死亡率居全國首位，是目前迫切解決的臨床重大問題之一。心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末病理改變，以細胞外基質大量沉積為特征，大量膠原沉積導致心臟僵硬度增加，導致心臟結構和功能紊亂。[2]研究認為，轉化生長因子β1(TGF-β1)是參與組織纖維化的主要調節(jié)者，在心肌纖維化和心室重構中起著至關重要的作用。[3]尖葉假龍膽(Gentianellaacuta，G.acuta)味苦，性涼，在內蒙古地區(qū)長期被用于治療心絞痛、快速性心律失常等疾病，療效顯著。[4]研究顯示，尖葉假龍膽對心肌具有保護作用[5]，本課題組于前期研究發(fā)現尖葉假龍膽可抑制心肌纖維化，但其詳細機制尚不完全清楚。[6]本研究旨在觀察尖葉假龍膽對TGF-β/Smad7信號通路的調控作用，以明確其抗心肌纖維化的可能作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，清潔級，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)，維持12 h光照和12 h黑暗晝夜循環(huán)，自由飲水和獲取食物。

1.2 主要藥物 尖葉假龍膽的帶根全草購自內蒙古市場，由河北中醫(yī)學院藥學院鄭玉光教授鑒定。按人與大鼠體表面積比率換算灌胃量，常規(guī)水煎，濃縮，4℃冰箱儲存，備用。

1.3 主要試劑與儀器 鹽酸異丙腎上腺素(ISO)購自日本TCI公司，戊巴比妥鈉購自Sigma公司，蘇木素和伊紅染液購自Sigma公司，Masson染色試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司，兔抗TGF-β1、兔抗Smad7均購自abcam公司，二氨基聯苯胺(DAB)購自武漢賽維爾生物科技有限公司，放射免疫法試劑盒購自北京北方生物技術研究所，酶聯免疫法試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司，高速低溫離心機購自德國Sigma公司，分析天平購自上海良平儀器儀表有限公司，RM6240多通道生理信號采集系統購自成都儀器廠，多功能顯微鏡購自德國Leica公司。

2 方法

2.1 實驗分組、模型制備及給藥 參照文獻采用ISO誘導大鼠心肌纖維化模型[7]。將24只大鼠隨機分為4組：對照組、模型組、尖葉假龍膽低劑量組(0.3 g/kg)和尖葉假龍膽高劑量組(0.6 g/kg)。動物適應性喂養(yǎng)1周，除對照組給予皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射ISO(5 mg/kg，每日1次)，連續(xù)注射7 d。按照人與大鼠體表面積比率換算給藥量，所有藥物均采用灌胃給藥，從首次注射ISO后次日開始灌胃，療程21 d。尖葉假龍膽低劑量組和高劑量組分別給予不同濃度尖葉假龍膽水提取液灌胃治療(灌胃體積10 mL/kg，每日1次)，對照組和模型組給予同等體積的純凈水灌胃。

2.2 標示采集與處理 實驗第22 d，稱量大鼠體質量、麻醉，充分暴露股動脈，取血，自然凝固后，3 000 r/min離心5 min，取上清。切取左心室部位組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行組織形態(tài)學、病理學和免疫組織化學染色。

2.3 心電圖(ECG) 實驗第22 d，大鼠麻醉后，將電極固定在毫針上，再將毫針插入大鼠足跖皮下部位，用RM6240多通道生理信號采集系統記錄II導聯心電圖，記錄速度為20 ms/div。

2.4 大鼠心臟組織病理學觀察 取左心室組織，4%多聚甲醛固定，組織經脫水、包埋、切片(厚約5 μm)，行HE、Masson染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心臟組織形態(tài)學和病理學改變。

2.5 免疫組織化學染色 采用SP9000免疫組織化學染色試劑盒進行檢測，心臟組織標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm的切片。切片經脫蠟至水、抗原修復，在室溫下，用3%過氧化氫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性，然后用3%山羊血清室溫孵育30 min以阻斷非特異性結合，隨后，一抗孵育(TGF-β1，1∶50；Smad7，1∶50)，4℃過夜。用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌后，按照SP9000試劑盒說明書操作，試劑3、4均在室溫下孵育15 min。室溫下DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素復染細胞核，切片經脫水、透明、封片，光鏡下觀察各組大鼠心臟組織中TGF-β1、Smad7的表達。

2.6 血清C反應蛋白(CRP)、TGF-β1檢測 實驗第22 d，稱量大鼠體質量、麻醉，暴露右側股動脈、取血，離心取上清液，采用酶聯免疫法測定血清CRP、TGF-β1含量。

2.7 血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)和Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNP)檢測 實驗第22 d，大鼠稱重、麻醉，暴露右側股動脈、取血，并離心取上清液，采用放射免疫法檢測血清PⅠCP、PⅢNP含量。

2.8 統計學處理 采用IBM SPSS Statistics21統計軟件對實驗數據進行統計學處理，計量資料采用均數 ± 標準誤(mean ± SEM)進行統計，對各檢測指標數據均進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。采用one-way ANOVA進行統計比較，以P<0.05作為統計學的差異有顯著性的標準，P<0.01作為統計學的差異有非常顯著性的標準。

3 結果

3.1 尖葉假龍膽改善ISO誘導的心臟功能紊亂 ECG記錄II導聯結果顯示，與對照組相比，ISO導致ST段壓低，而尖葉假龍膽治療可改善ST段壓低情況。見圖1。

3.2 尖葉假龍膽抑制ISO誘導的大鼠心肌纖維化 HE染色結果顯示，對照組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌間質結構正常。與對照組相比，模型組可見廣泛心內膜下梗死，梗死區(qū)心肌細胞變性壞死、心肌纖維結構紊亂。與模型組相比，尖葉假龍膽干預組心肌梗死面積明顯減少，心肌細胞壞死和心肌纖維結構紊亂程度明顯改善。見圖2。

圖1 尖葉假龍膽改善ISO所致的ST段改變

注：與對照組相比較，##P<0.01；與模型組相比較，**P<0.01。

Masson染色顯示，對照組可見少量藍染的膠原纖維散在分布于細胞間質，模型組在心肌梗死區(qū)可見連成片的藍色膠原纖維聚積，表明有大量膠原沉積，尖葉假龍膽干預組膠原沉積較模型組明顯減少。見圖3。

3.3 尖葉假龍膽抑制ISO誘導的心臟組織TGF-β1蛋白表達 免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，ISO所致的纖維化心臟組織中TGF-β1表達顯著增多，與模型組相比，不同劑量的尖葉假龍膽干預均可減少TGF-β1表達。見圖4。

注：與對照組相比較，##P<0.01；與模型組相比較，**P<0.01。

注：與對照組相比較，##P<0.01；與模型組相比較，**P<0.01。

3.4 尖葉假龍膽上調ISO誘導的心臟組織Smad7蛋白表達 免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，可見ISO所致的心臟組織非梗死區(qū)Smad7表達減少，梗死區(qū)Smad7蛋白表達增加，與模型組相比，不同劑量的尖葉假龍膽干預均增加梗死區(qū)和非梗死區(qū)Smad7表達。見圖5。

3.5 尖葉假龍膽下調ISO誘導的血清TGF-β1水平 血清檢測表明，與對照組相比，模型組血清CRP、TGF-β1水平明顯升高，差異具有非常顯著性(P<0.01)；與模型組相比，尖葉假龍膽高低濃度干預均可下調血清TGF-β1水平，差異具有顯著性(P<0.05)，尖葉假龍膽可降低血清CRP水平，但差異無顯著性。見圖6。

圖5 尖葉假龍膽增加ISO誘導的心臟組織Smad7表達(免疫組織化學染色，×100)

注：與對照組相比較，##P<0.01；與模型組相比較，*P<0.05。

3.6 尖葉假龍膽降低ISO誘導的PⅢNP水平升高 放射免疫法檢測表明，與對照組相比，模型組血清PⅠCP和PⅢNP水平明顯升高，差異具有非常顯著性(P<0.01)；與模型相比，不同劑量尖葉假龍膽干預均可降低PⅢNP水平，差異具有顯著性(P<0.05)，尖葉假龍膽可下調血清PICP水平，但差異無顯著性。見圖7。

注：與對照相比較，##P<0.01；與模型組相比較，*P<0.05。

4 討論

心肌梗死是最常見的心血管疾病之一，中醫(yī)多將其歸屬于“胸痹”范疇，古代醫(yī)家經過長期臨床實踐認為“熱毒”是胸痹發(fā)生的主要原因之一。《素問·刺熱》指出：“心熱病者，先不熱，數日乃熱，熱則卒心痛。”認為熱郁日久可致心痛發(fā)生。后世醫(yī)家亦提出火熱毒邪可致胸痹，如《血證論》：“火不宣發(fā)則為胸痹”，何秀山認為：“火盛者必有毒”。現代醫(yī)家也認為熱毒是胸痹的致病因素，或者是胸痹的病理產物。[8]王創(chuàng)暢等對臨床急性心肌梗死患者做回顧性研究發(fā)現，對于納入研究的322例患者進行證候分析，熱毒證患者共136例，占42.24%。[9]丁書文教授根據多年臨床經驗，提出“冠心病熱毒學說”。[10]因此，“熱毒”是導致胸痹發(fā)生發(fā)展的主要因素之一。

臨床實驗中應用清熱毒中藥治療胸痹心痛往往療效確切[11]。尖葉假龍膽是龍膽科假龍膽屬植物，味苦，性涼，具有清熱解毒之效，在內蒙古被用于治療肝炎、黃疸、發(fā)熱、頭痛等疾病，民間藥用植物調查顯示，內蒙古呼倫貝爾地區(qū)的牧民長期應用其治療心絞痛，而被稱為“歸心草”。大量實驗結果表明，尖葉假龍膽及其活性成分具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗心律失常的作用，可預防心腦血管病。[12]研究顯示，尖葉假龍膽富含口山酮成分，對H2O2誘導的心肌細胞損傷和心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用。[5，13]本課題組前期研究發(fā)現，尖葉假龍膽可減輕心肌梗死后纖維化。[14]

心肌梗死后修復性纖維化，細胞外基質大量產生和沉積，使心室僵硬度增加，導致心臟收縮和舒張功能障礙，這些病理改變可以導致心力衰竭，甚至發(fā)生心臟猝死。[15]因此，減少膠原產生和沉積是防治心肌纖維化的主要策略之一。TGF-β1是最重要的促纖維化因子，參與多種器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，研究表明，心肌纖維化過程中，TGF-β1表達增加，促進膠原合成。[16]TGF-β通過其下游Smads信號分子發(fā)揮生物學效應，[17]Smad7被認為是TGF-β信號的負反饋調節(jié)分子。研究顯示，心肌梗死后8周，可見Smad7蛋白表達和mRNA水平下調。[18]因此，調控TGF-β/Smad7信號通路對防治心肌梗死后纖維化具有重要意義。

ISO是一種β腎上腺素受體激動劑，因其可引起心內膜下心肌缺血、缺氧、代謝和生物化學改變、炎癥、變性、壞死和心臟重構，進而導致心肌損傷，已被廣泛用于研究心肌梗死后纖維化。[19]本研究采用ISO皮下注射建立心肌梗死后纖維化模型，采用尖葉假龍膽干預治療。實驗結果顯示，尖葉假龍膽能夠改善心ISO所致的心臟功能紊亂，明顯減少心肌梗死面積，減少心肌細胞壞死，改善心肌纖維結構紊亂程度。Masson染色顯示，尖葉假龍膽可減少膠原沉積。進一步研究發(fā)現，尖葉假龍膽抑制心臟組織TGF-β1，上調Smad7表達。血清檢測也證實，尖葉假龍膽可下調血清TGF-β1水平，降低血清PⅢNP水平。因此，尖葉假龍膽具有抑制心肌纖維化的作用，并且其抗心肌纖維化的作用則是通過調控TGF-β1/Smad7信號通路而發(fā)揮效應。