通過SIRT1信號通路探究滌痰止暈方對缺血性眩暈大鼠腦組織作用的影響*

唐山市豐潤區中醫醫院

趙元奎 安志紅△ 周淑紅△ 王久敏△ 李春蕾△(唐山 064000)

提要 目的：研究分析滌痰止暈方通過沉默信息調節因子1(SIRT1)信號通路對缺血性眩暈大鼠腦組織的影響。方法：選SPF級健康雄性SD大鼠60只，隨機分為假手術組10只和造模組50只。造模組采用右頸總動脈和右鎖骨下動脈結扎法建立缺血性眩暈模型，假手術組大鼠接受假手術。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、鹽酸地芬尼多組及滌痰止暈方低、中、高濃度組，各10只。模型組、假手術組分別給予生理鹽水 5 mL/kg，每日1次，灌胃給藥；鹽酸地芬尼多組給予3 mg/mL鹽酸地芬尼多溶液 5 mL/kg，每日1次，灌胃給藥；滌痰止暈方低、中、高濃度組分別給予生藥濃度為0.2、0.4、0.8 g/mL的滌痰止暈方5 mL/kg，每日1次，灌胃給藥。各組大鼠均給藥1周。檢測比較各組逃避電擊潛伏期、腦組織能量代謝及氧化應激指標水平，以及腦組織SIRT1、過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)、磷酸化叉頭框蛋白O3α(p-FOXO3α)表達水平。結果：與模型組比較，各組大鼠逃避電擊潛伏期較短，腦組織乳酸(Lac)、乳酸脫氫酶(LDH)水平較低，腦組織丙二醛(MDA)水平較低，且滌痰止暈方低濃度組>滌痰止暈方中濃度組>滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異均有顯著性(均P<0.05)。與模型組比較，各組大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)水平較高，腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平較高，且滌痰止暈方低濃度組<滌痰止暈方中濃度組<滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異有顯著性(P<0.05)。結論：滌痰止暈方能劑量依賴性的縮短缺血性眩暈大鼠逃避電擊潛伏期，改善腦組織能量代謝，抑制氧化應激反應，其作用可能與上調SIRT1信號通路活性有關。

缺血性眩暈是由于前庭神經和感受器、及相關中樞神經缺血引起的空間定向障礙、平衡功能紊亂所導致的運動性幻覺，以突然發生的自身或(和)外界物體旋轉感、浮沉感、搖擺感、漂移感等為主要表現。[1]眩暈為臨床常見病之一，據統計，在成年人群中該病發病率高達20%～30%，[2]其主要包括周圍性眩暈和中樞性眩暈兩大類，其中包括缺血性眩暈在內的中樞性眩暈約占10.1%～11.0%。[2]缺血性眩暈常繼發于椎-基底動脈供血不足、腦梗死等缺血性腦血管病，一般伴有惡心嘔吐、出汗、平衡失調、站立不穩、傾倒、眼震等癥狀，對患者的日常生活造成嚴重影響。目前，西醫主要采用抗眩暈劑、鎮靜劑、脫水藥、改善循環藥物等對缺血性眩暈進行治療[4]，能夠在一定程度上緩解眩暈癥狀，但無法有效減少眩暈的發生，治療效果并不理想。中醫藥在眩暈的治療中有悠久的歷史和豐富的經驗，已經有研究證實[5]，中醫藥治療缺血性眩暈的臨床效果較好，但相應的實驗研究較少。本次研究就是主要探討中藥復方滌痰止暈方通過沉默信息調節因子1(SIRT1)信號通路對缺血性眩暈大鼠腦組織的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：60只7～8周齡SPF級健康雄性SD大鼠，購自天津市中醫藥大學第一附屬醫院，動物許可證號：SCXK(津)2015-0003，體質量280～300 g。所有大鼠置于動物房內飼養，每個鼠籠5只，室內環境設定為溫度22～24℃，相對濕度45%～55%，噪音低于50 dB，照明時間7：00～19：00，通風良好，飼以充足的普通標準飼料和蒸餾水，大鼠自由進食和飲水，定期清掃鼠籠、消毒。

1.1.2 主要藥品與試劑：滌痰止暈方(組成：白術、陳皮各10 g，天麻12 g，薏苡仁15 g，石菖蒲、半夏、川芎各 12 g，赤芍15 g)，藥物購自天津中醫藥大學第一附屬醫院，使用時加水浸泡30 min，煎煮2次，濃縮為生藥濃度為0.2、0.4、0.8 g/mL的滌痰止暈方藥液，置于-20℃冰箱保存備用。鹽酸地芬尼多片，規格：每片25 mg，國藥準字H51022154，批號：20180130，購自地奧集團成都藥業股份有限公司，使用時用蒸餾水制備成濃度為3 mg/mL的鹽酸地芬尼多，現用現配；注射用青霉素鈉，規格：每支80萬單位，國藥準字H41020094，批號：20180207，購自天津藥業焦作有限公司。10%水合氯醛，購自武漢遠城科技發展有限公司；乳酸(Lac)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)酶聯免疫分析(ELISA)法檢測試劑盒，購自南京金益柏生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液、TBST緩沖液，購自孟成科技(上海)有限公司；細胞裂解液，購自上海浩然生物技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，購自北京嘉美紐諾生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒，購自北京紐樸生物技術有限公司；兔抗鼠SIRT1、過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)、磷酸化叉頭框蛋白O3α(p-FOXO3α)、肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體，購自上海邦奕生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，購自合肥博美生物科技有限責任公司；氧化二氨基聯苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒，購自上海信裕生物科技有限公司；ECL超敏發光液，上海勤翔科學儀器有限公司。

1.1.3 主要儀器設備：TD-420型臺式低速離心機，四川蜀科儀器有限公司產品；yls-3tb型跳臺記錄儀，安徽正華生物儀器設備有限公司產品；BEPTMⅢ型酶聯免疫分析系統，德國Siemens公司產品；Invitrogen iBright型凝膠成像系統，美國Thermo Fisher Scientific公司產品。

1.2 方法

1.2.1 造模及實驗方法[6]：適應性飼養5 d后，將所有大鼠編號并標記，按隨機數字表法隨機分為造模組50只和假手術組10只。所有大鼠均接受跳臺逃避電刺激反射訓練，每日2次，連續3 d，訓練至大鼠受到電刺激跳上跳臺儀平臺并保持30 s，建立牢固的逃避電刺激的條件反射；第4 d禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg充分麻醉，采用仰臥位在手術臺上固定，頸部常規備皮、消毒，于頸前作縱向切口，逐層切開，尋找并暴露右頸總動脈，造模組進行結扎，之后沿右頸總動脈找到右鎖骨下動脈并結扎；假手術組僅暴露右頸總動脈和右鎖骨下動脈，不進行結扎；術畢清理傷口，逐層關閉，并采用青霉素溶液涂抹；給予注射用青霉素鈉4萬單位，每日1次，尾靜脈注射，連續給藥3 d預防感染。術畢待大鼠清醒后，將其置于離心機內500 r/min旋轉30 s驟停，之后立即進行跳臺逃避電刺激實驗，若大鼠從受到電刺激到跳上跳臺儀平臺并保持30 s不跌落需要的時間(即逃避電擊潛伏期)>150 s，即為成功建立缺血性眩暈模型。按照隨機原則及時補齊造模過程中失敗或意外死亡的大鼠。

成功建立缺血性眩暈模型的大鼠并隨機分為模型組、鹽酸地芬尼多組及滌痰止暈方低、中、高濃度組，各10只。術后第2 d開始，模型組、假手術組分別給予生理鹽水 5 mL/kg，每日1次，灌胃給藥；鹽酸地芬尼多組給予3 mg/mL鹽酸地芬尼多溶液5 mL/kg，每日1次，灌胃給藥；滌痰止暈方低、中、高濃度組分別給予生藥濃度為0.2、0.4、0.8 g/mL的滌痰止暈方5 mL/kg，每日1次，灌胃給藥。各組大鼠均連續給藥1周。

1.2.2 眩暈測試：末次給藥后1 h，將大鼠置于離心機內500 r/min旋轉，30 s后驟停，之后立即置于yls-3tb型跳臺記錄儀內，給予30 V、50 Hz電刺激5 min，進行跳臺逃避電刺激實驗，記錄大鼠的逃避電擊潛伏期。

1.2.3 標本采集與處理[7]：眩暈測試結束后，將大鼠斷頭處死，迅速摘取右側大腦半球，預冷的生理鹽水沖去血液后迅速置于冰盤上，取1/2右側大腦半球，置于含有9倍量生理鹽水的勻漿器內，制成10%組織勻漿液，以 3 500 r/min速度離心10 min，獲得的組織上清液，保存于-80℃冰箱內；剩余1/2右側大腦半球經液氮速凍后，保存于-80℃冰箱內以備后續蛋白免疫印跡實驗(Western-blot)檢測。

1.2.4 ELISA法檢測大鼠腦組織能量代謝及氧化應激指標水平[8]：取步驟1.2.3中制備的腦組織上清液，置于4℃冰箱內解凍，按照試劑盒說明書中的操作方式，采用酶免之星TM全自動酶免分析儀，通過ELISA法檢測腦組織上清液中能量代謝指標Lac、LDH水平及氧化應激指標SOD、MDA水平。

1.2.5 Western-blot法檢測大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平[9]：取1.2.3中凍存的腦組織→采用液氮迅速研磨→PBS沖洗5 min×2次→以3 500 r/min速度離心5 min×2次→加入細胞裂解液150 μL混勻，4℃反應30 min→4℃條件下，以12 000 r/min速度離心2 min，獲得總蛋白提取液→BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量→SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制分離膠和濃縮膠，灌注于電泳儀上→電泳至溴酚藍跑出分離膠底部→取目的蛋白所在凝膠，用轉移緩沖液平衡4 min→將目的蛋白轉印至硝酸纖維素(Nc)膜上→PBS浸洗Nc膜12 min→室溫下，用5%脫脂奶粉封閉Nc膜3 h→4℃條件下，用SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α、內參β-actin單克隆抗體工作液(1∶500稀釋)孵育16 h→TBST緩沖液沖洗10 min×3次→4℃條件下，用辣根酶標記山羊抗兔IgG工作液(1∶2 000稀釋)孵育1 h→TBST緩沖液沖洗5 min×2次→采用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒使目的蛋白顯色→在暗室內，采用ECL超敏發光液顯影、曝光、定影。

采用凝膠成像系統掃描蛋白條帶并拍照，用IPP6.0軟件分析各目的蛋白灰度值，計算p-SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α灰度值與內參β-actin灰度值的比值，明確各目的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析 所有統計數據均統一整理，采用SPSS22.0軟件包分析，符合正態性的計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異存在顯著性；組間多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異存在顯著性。

2 結果

2.1 各組大鼠逃避電擊潛伏期情況比較 與假手術組比較，模型組大鼠逃避電擊潛伏期延長，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠逃避電擊潛伏期較短，其中滌痰止暈方低濃度組>滌痰止暈方中濃度組>滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異均有顯著性(P<0.05)。詳見表1。

表1各組大鼠逃避電擊潛伏期比較

2.2 各組大鼠腦組織Lac、LDH水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織Lac、LDH水平升高，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠腦組織Lac、LDH水平較低，其中滌痰止暈方低濃度組>滌痰止暈方中濃度組>滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異均有顯著性(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織Lac、LDH水平比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低濃度組比較，△P<0.05；與中濃度組比較，◇P<0.05；與高濃度組比較，▲P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SOD水平降低，MDA水平升高，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠腦組織SOD水平較高，其中滌痰止暈方低濃度組<滌痰止暈方中濃度組<滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異均有顯著性(P<0.05)。與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠腦組織MDA水平較低，其中滌痰止暈方低濃度組>滌痰止暈方中濃度組>滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異均有顯著性(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較

2.4 各組大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平降低，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平較高，其中滌痰止暈方低濃度組<滌痰止暈方中濃度組<滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組，差異均有顯著性(P<0.05)。詳見表4、圖1。

表4各組大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平比較

注：A 假手術組；B 模型組；C 低濃度組；D 中濃度組；E 高濃度組； F 鹽酸地芬尼多組。圖1 Weesterrn-blot法檢測各組大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達結果

3 討論

缺血性眩暈主要以椎-基底動脈、大腦后動脈等后循環供血不足為主，該現象長期存在可使小腦、枕葉、腦干等受血區域腦組織發生缺血性損傷，產生神經功能障礙，從而引發相關癥狀。因此，單純的對癥抗眩暈對于病情進展沒有良好的抑制效果，尋找有效藥物保護缺血腦組織才是治療的關鍵。在中醫理論中，缺血性眩暈也屬于“眩暈”范疇[10]，病機十分復雜，主要包括“虛”“風”“痰”“瘀”4個方面，治療上常以健脾補虛、平肝熄風、滌痰定眩、活血化瘀等為主。此次主要探討滌痰止暈方對于缺血性眩暈大鼠腦組織及SIRT1信號通路的影響。滌痰止暈方中白術性溫，味苦甘，能健脾益氣，燥濕利水，為“補氣健脾第一藥”；陳皮性溫，味苦辛，可理氣健脾，燥濕化痰；天麻性辛溫，味甘平，能平肝息風，定驚；薏苡仁性涼，味甘淡，可健脾滲濕；石菖蒲性溫，味苦辛，能化濕豁痰，開竅醒神；半夏性溫味辛，可燥濕化痰，降逆止嘔；川芎性溫味辛，能行氣開郁，祛風燥濕，活血止痛；赤芍性微寒微苦，有清熱涼血，活血化瘀之效。全方藥物配伍得當，共奏健脾補虛、平肝熄風、化痰開竅、行氣活血之效。王久敏等[11]研究認為，滌痰止暈方能有效改善陣發性位置性眩暈患者的癥狀?，F代藥理研究也顯示，天麻中的主要成分天麻素具有擴張腦血管、改善腦供血、鎮靜安眠、保護神經細胞等作用，對缺血性眩暈大鼠有確切的治療效果；[12]川芎嗪是川芎中的活性成分，能通過抗氧化、抗凋亡途徑保護腦組織和神經系統，與天麻素聯用能有效改善老年患者眩暈癥。[13]

在本研究中，筆者采用不同濃度的滌痰止暈方對缺血性眩暈模型大鼠進行干預，結果發現，與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠逃避電擊潛伏期較短，其中滌痰止暈方低濃度組>滌痰止暈方中濃度組>滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組(P<0.05)，缺血性眩暈模型大鼠前庭感受器及前庭神經核供血不足，容易在受到旋轉刺激的情況下出現平衡障礙，無法因電刺激而迅速跳上平臺躲避，使得逃避電擊潛伏期延長，而上述研究結果表明，滌痰止暈方能劑量依賴性的縮短模型大鼠逃避電擊潛伏期，即有效減輕缺血性眩暈相關癥狀，起到較好的治療效果。

能量代謝障礙以及氧化應激反應均是導致缺血性腦損傷的重要原因和機制。Lac和LDH均為能量代謝相關指標，Lac是腦組織無氧糖酵解的產物，需要在LDH的催化作用下轉化為丙酮酸，才能進行有氧代謝，為腦組織提供可用能量，生理情況下，神經系統以有氧代謝為主，腦組織內Lac、LDH含量均較少，而缺血性眩暈發生時，局部腦組織缺血缺氧導致Lac、LDH水平異常升高，可以作為反映腦缺血損傷程度的指標。[14]另外，腦缺血缺氧還能刺激氧自由基生成，直接導致神經元氧化損傷。SOD屬于重要的自由基清除酶，與肌體抗氧化能力有關；MDA則是脂質過氧化代謝產物，可反映氧化應激反映程度。[15]此次研究顯示，模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠腦組織Lac、LDH、MDA水平較低，SOD水平較高，滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組與模型組差異最為明顯，表明滌痰止暈方能明顯改善模型大鼠腦組織能量代謝，減輕氧化應激反應造成的腦組織損傷，控制病情進展。

關于滌痰止暈方的具體作用機制，筆者從SIRT1信號通路方面進行了探討。SIRT1屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙?；福诩◇w內廣泛分布，能夠調節多種細胞功能，發揮神經保護作用。[16]PGC-1α和p-FOXO3為SIRT1的下游分子，PGC-1α能補償神經細胞線粒體的功能下降，在氧化損傷中保護神經細胞，[17]還能活化能量代謝相關的因子，保護腦組織能量供應；p-FOXO3則為細胞應對氧化應激的調節劑，能夠直接促進SOD表達，也能于PGC-1α形成復合體上調抗氧化基因表達，防止氧化應激引起細胞損傷和凋亡。本研究結果顯示，與模型組比較，滌痰止暈方低、中、高濃度組和鹽酸地芬尼多組大鼠腦組織SIRT1、PGC-1α、p-FOXO3α表達水平較高，其中滌痰止暈方低濃度組<滌痰止暈方中濃度組<滌痰止暈方高濃度組和鹽酸地芬尼多組(P<0.05)，表明滌痰止暈方能上調SIRT1及下游分子PGC-1α、p-FOXO3α表達水平，激活SIRT1信號通路，從而改善腦能量代謝，抑制氧化應激反應。

綜上所述，滌痰止暈方能劑量依賴性的縮短缺血性眩暈大鼠逃避電擊潛伏期，改善腦組織能量代謝，抑制氧化應激反應，其作用可能與上調SIRT1信號通路活性有關。