急性冠脈綜合征患者的中醫證型分布與外周血單核細胞TLR4、TNF-α水平變化的關系*

河北醫科大學第一醫院心血管內科

劉曉麗 段立楠 張立新△ 李茜茜△△ 耿艷華△△ 焦麗璇△△ 陳 燕△(石家莊 050030)

提要 目的：研究急性冠脈綜合征(ACS)患者的中醫證型分布情況，并對其外周血白細胞分化抗原14陽性單核細胞Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平變化與中醫證型關系進行分析。方法：將45例ACS的患者，以中醫辨證分為痰濁閉阻、氣滯血瘀、心腎陰虛和陽氣虛證，并空腹采集靜脈血檢測血清血脂水平、外周血TLR4、TNF-α水平，根據Gensini積分對各證型冠狀動脈病變程度進行評估，分析各證型組外周血TLR4、TNF-α水平與Gensini積分相關性。結果：在45例ACS患者中，痰濁閉阻和氣滯血瘀證患者占76%，心腎陰虛和陽氣虛證患者僅占24%。對患者進行實驗室檢測，可見痰濁閉阻證患者血清的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)水平高于氣滯血瘀證患者(P<0.01)，氣滯血瘀和陽氣虛證ACS患者外周血TLR4和TNF-α水平顯著低于痰濁閉阻證和心腎陰虛證(P<0.05)。且TLR4、TNF-α水平與Gensini積分呈正相關。結論：ACS患者中醫辨證多屬痰濁閉阻證或氣滯血瘀證，其中痰濁閉阻證和心腎陰虛證患者血脂、外周血TLR4、TNF-α水平較高，預示其血管中炎性損傷較為嚴重，病情可能較其他證型危重。

冠心病是嚴重威脅人類健康的一類疾病，因其發病率高、死亡率高，備受醫學界的關注。急性冠脈綜合征(ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成、破裂，繼發完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的臨床綜合征，炎癥反應及損傷在此過程中有重要作用。動脈管壁存在配體時Toll樣受體4(TLR4)通路活化，啟動信號傳導，激活TLR4/NF-κB細胞信號通路，使下游炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等過表達，損傷內皮細胞完整結構，加速炎癥細胞浸潤、形成脂質核心，促進動脈粥樣硬化發生、發展，直至斑塊破裂發生臨床急性心血管事件。[1]中醫并無ACS此病名，當屬“胸痹心痛”“真心痛”范疇，對本病多從虛實論證，認為以實證多見，虛證較少。[2]本研究將探討ACS患者外周血單核細胞TLR4、TNF-α的水平變化與中醫證型的相關性，為本病的中醫辨證論治提供循證依據。

1 臨床資料

1.1 研究對象 為2019年1月至2019年6月于我院初診冠心病患者45例。

1.2 納入及診斷標準 診斷標準參照臨床通行診斷標準制訂。[3]冠心病診斷標準符合世界衛生組織相關診斷標準，冠狀動脈造影(CAG)至少一支冠狀動脈內狹窄≥50%；年齡45～70歲；患者自愿參加，并簽署知情同意書。中醫診斷參照《中藥新藥臨床研究指導原則·中藥新藥治療冠心病心絞痛的臨床研究指導原則》和《中醫診斷學》，結合中醫臨床經驗，將患者分為：⑴痰濁閉阻證：胸悶痛或痛引肩背，體胖多痰，肢體重著，頭暈頭昏，氣短喘促，舌苔濁膩或滑，脈滑。⑵氣滯血瘀證：胸悶或疼痛，胸脅脹滿，心悸，唇舌紫黯，脈澀。⑶心腎陰虛證：胸部隱痛，煩躁，失眠多夢，形體消瘦，潮熱盜汗，舌紅少津，脈沉細數。⑷陽氣虛證：胸悶氣短，甚至胸痛徹背，心悸汗出，面色蒼白，唇甲淡白或青紫，畏寒肢冷，舌淡白，脈沉細或沉微欲絕。

1.3 排除標準 除外嚴重心功能及肝腎功能不全、惡性高血壓、惡性腫瘤、血液系統疾病、急慢性感染、自身免疫疾病、嚴重藥物過敏者。

2 方法

2.1 收集一般資料 患者入組后由課題組成員收集患者一般資料，包括性別、年齡、病程、身體質量指數(BMI)等，并由中醫師對患者進行辨證分型。

2.2 檢測血清血脂和TNF-α水平 研究對象入組時，各證型患者均在清晨靜息狀態下取靜脈血5 mL，靜置、離心、分離血清，檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)等生化指標。ELISA測定血清TNF-α濃度。

2.3 檢測外周血單核細胞TLR4的表達 取2個試管，各加入用EDTAK2抗凝全血100 μL，鼠抗人熒光標記單克隆抗體CD14-FITC 20 μL，再分別加入PE標記人抗TLR4單抗20 μL(A管)，羊抗鼠FITC-IgG和羊抗鼠PE-IgG二抗工作液20 μL做陰性對照(B管)。用震蕩器混勻后室溫避光孵育30 min。用Q-PREP標本處理儀(美國，Coulter公司)進行細胞固定和破膜。流式細胞儀檢測采用SSC設門，CD14-FITC陽性細胞為門(CD14-FITC陽性為單核細胞)，測定門內10 000個單核細胞的mCD14、TLR4表達百分率。見圖1、圖2。用Expo32ADC進行免疫熒光數據分析。

注： SSC設門，CD14-FITC陽性細胞為門(CD14-FITC陽性為單核細胞)。

注：測定門內10 000個單核細胞的mCD14、TLR4表達百分率。

2.4 Gensini積分標準[4]⑴根據冠狀動脈狹窄最嚴重處狹窄程度占比賦值1～32分確定基本評分。(2)根據冠狀動脈病變部位賦值5～1分確定評分系數。最終積分為各分支積分之和。

3 結果

3.1 ACS患者中醫證型分布情況 45例患者辨證主要屬痰濁閉阻證(18例)和氣滯血瘀證(16例)，兩者占76%；其次為心腎陰虛證(6例)和陽氣虛證(5例)。結果詳見表1 。

表1ACS各證型患者一般資料比較

3.2 ACS各證型患者一般資料比較 由表1結果可見，納入的辨證屬痰濁閉阻證、氣滯血瘀證、心腎陰虛證和陽氣虛證的患者的年齡、性別比例、病程方面比較差異無顯著性(P>0.05)。辨證屬痰濁閉阻證的患者身體質量指數 (BMI)顯著高于氣滯血瘀證、心腎陰虛證患者(P<0.05)，與陽氣虛證患者差異無顯著性(P>0.05)。

3.3 ACS各證型患者血脂水平比較 ACS患者血清TC和TG平均水平高于正常值，LDLC和HDLC平均水平則在正常范圍。各證型患者比較，與痰濁閉阻證患者TC和LDLC水平相比，氣滯血瘀證患者水平較低，且差異具有非常顯著性(P<0.01)；心腎陰虛證和陽氣虛證患者則差異無顯著性(P>0.05)；各證型患者血清TG和HDLC水平差異無顯著性(P>0.05)。詳見表2。

3.4 ACS各證型患者TLR4與TNF-α水平比較 各證型ACS患者外周血TLR4表達與TNF-α水平差異有顯著性。與痰濁閉阻證ACS患者外周血TLR4表達和TNF-α水平比較，氣滯血瘀證、陽氣虛證患者水平顯著降低(P<0.05)，心腎陰虛證患者則差異無顯著性(P>0.05)。詳見表3。

3.5 TLR4、TNF-α水平與Gensini評分相關性分析 經直線相關分析研究發現，ACS患者外周血TLR4表達水平與Gensini評分呈正相關，相關系數γ=0.86，P<0.01。患者外周血TNF-α水平與Gensini評分也呈正相關，相關系數γ=0.85，P<0.01。見圖3。

表2ACS各證型患者血脂水平比較

表3 ACS各證型患者TLR4與TNF-α水平比較

圖3 外周血TLR4、TNF-α表達水平與Gensini評分相關性

4 討論

ACS屬中醫學“真心痛”“胸痹心痛”范疇。中醫除辨病外，更注重辨證論治，結合患者的病因、癥狀、體征和舌象脈診綜合評估其所屬證型。目前，ACS的中醫分型多遵從虛實辨證原則，認為本病多見于實證，虛證較少，以血瘀、痰濁為主，氣滯次之，陰虛、陽虛較少。[2]現代研究證實，ACS的中醫辨證分型與實驗室檢測指標存在相關性，并與疾病嚴重程度和預后相關。因此，本項研究通過對患者的臨床體征和既往病史進行分析，將ACS進行辨證分為痰濁閉阻、氣滯血瘀、心腎陰虛和陽氣虛4種證型，并與血脂水平、外周血單核細胞TLR4、TNF-α的水平變化進行相關性分析，以為中醫治療ACS提供有益參考。

現代研究顯示，局部和全身的免疫反應在動脈粥樣硬化(AS)發展中有重要作用。TLR4介導的免疫及慢性炎癥參與AS發展全過程，下游TNF-α是其中重要的炎性因子，參與AS炎癥損傷，造成斑塊進展。[4]不穩定斑塊破裂及其繼發性血栓是ACS的主要原因，急性炎性反應是斑塊易損不穩定的主要原因。TLR4是一類模式識別受體，炎癥信號傳遞蛋白，可識別微生物特定分子成分，活化信號傳導途徑，啟動并協調免疫反應、脂質代謝、慢性炎癥，但其活性過強可引發炎癥損傷。[5]TLR4/NF-κB細胞信號通路是介導炎癥反應的關鍵環節。氧化脂蛋白等內源性配體激活TLR4后，NF-κB活化轉移至核內，啟動炎性細胞因子的轉錄和表達，促使炎性因子TNF-α等大量釋放。[6]TNF-α是由被激活的單核細胞、淋巴細胞等產生的多肽，其與靶細胞上相應受體結合引發生物學效應，可參與多種疾病的病理生理過程，在肌體免疫調節和炎癥反應中具有重要作用。TNF-α是導致動脈內皮細胞功能紊亂、內膜增生的重要因素。[7]TNF-α誘導血小板黏附，增強白細胞趨化的作用，可引起病灶周圍細胞聚集，血管細胞異常增殖；直接損傷血管內皮細胞，誘導脂質沉積形成斑塊，誘發血管炎癥。[8]TNF-α介導動脈血管平滑肌細胞凋亡，加速動脈粥樣硬化的作用機制皆與斑塊炎癥有關。[9]這些研究都證實，ACS患者外周血TLR4、TNF-α水平升高，及其介導的信號通道可能參與了本病冠脈粥樣斑塊破裂及血栓形成與炎癥急性發展的病理進程，其表達水平與冠狀動脈病變程度具有相關性。因此說，外周血TLR4、TNF-α水平對病情有一定預測作用，可綜合評價ACS的發展。[10]

本研究入組45例ACS患者，辨證主要屬痰濁閉阻證(18例)和氣滯血瘀 證(16例)，兩者占76%；心腎陰虛證(6例)和陽氣虛證(5例)則較少，僅占24%，與文獻報道一致。[2]各證型患者的年齡、性別比例相仿；心腎陰虛、陽氣虛患者的病程略長于痰濁閉阻證和氣滯血瘀證型患者，但差異無顯著性(P>0.05)；氣滯血瘀證和心腎陰虛證患者的BMI明顯低于痰濁閉阻證和陽氣虛證患者。本研究通過對各證型ACS患者進行實驗室檢測，發現痰濁閉阻證、心腎陰虛證和陽氣虛證患者血清的TC、LDLC水平明顯高于氣滯血瘀證患者，氣滯血瘀證和陽氣虛證ACS患者外周血TLR4和TNF-α水平顯著低于痰濁閉阻證和心腎陰虛證。研究結果顯示，在不同證型ACS患者疾病過程中，血脂水平、外周血TLR4和TNF-α水平存在顯著差異，說明不同證型患者血管中炎癥反應程度有所不同，而過度的炎癥反應會造成不同程度損害，表現不同程度的臨床病理生理狀態。且ACS患者外周血TLR4、TNF-α水平與Gensini積分呈正相關，即外周血TLR4、TNF-α水平客觀反映了ACS患者的病情。研究結果說明，在ACS患者中，辨證屬痰濁閉阻和心腎陰虛者血管中炎性損傷較為嚴重，病情可能較其他證型更為危重。本項研究可能ACS的中醫診療提供臨床參考。