高尿酸對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響及其相關(guān)機(jī)制探討

劉迪丹，高凱，謝揚(yáng)，李智

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是嘌呤代謝紊亂引起的一種代謝性疾病，隨著人們生活水平的逐漸提高，HUA患病率也顯著升高。臨床上，高尿酸血癥與多種心血管疾病密切相關(guān)，包括心房顫動(dòng)［1］、缺血性心臟病［2-3］、心力衰竭［4-5］等，但高尿酸血癥與心血管疾病之間關(guān)系的分子機(jī)制仍未明確。正常水平的尿酸具有抗氧化作用，然而近年研究發(fā)現(xiàn)高尿酸在體內(nèi)外可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞［6］、腎小球系膜細(xì)胞［7］、泡沫細(xì)胞［8］等靶細(xì)胞氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、腎損傷、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)。對(duì)于心肌細(xì)胞，高尿酸能否通過(guò)引起氧化應(yīng)激進(jìn)而影響其活力，相關(guān)研究較少。MAPK（mitogen-activated protein kinase）信號(hào)途徑是許多細(xì)胞外刺激作用的重要信號(hào)傳導(dǎo)通道，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、P38和c-Jun三條途徑，是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、損傷等病理生理過(guò)程。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen specie，ROS）可調(diào)節(jié)ERK/P38信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致細(xì)胞去分化和炎癥反應(yīng)［9］。然而，高尿酸是否可通過(guò)氧化應(yīng)激干擾心肌細(xì)胞ERK/P38信號(hào)通路進(jìn)而影響心肌細(xì)胞活力仍不清楚。本研究旨在觀(guān)察高尿酸在體外對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響，并對(duì)其可能的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 H9c2大鼠心肌細(xì)胞標(biāo)本（CRL-1446）購(gòu)自美國(guó)Manassas，VA公司。3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）、2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）ROS熒光探針、尿酸、PD98059（ERK抑制劑）和胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。兔抗鼠磷酸化/總ERK（P-ERK/T-ERK）抗體、兔抗鼠磷酸化/總P38（P-P38/TP38）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；兔抗鼠GAPDH和SB203580（P38抑制劑）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。N-乙酰半胱氨酸（NAC，抗氧化劑）購(gòu)自美國(guó)ENZO Life Sciences公司。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM高糖、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（32106）購(gòu)自賽默飛世爾生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購(gòu)自上海Millipore公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-15AC）購(gòu)自SANYO公司；倒置顯微鏡（CX41）購(gòu)自日本OLYMPUS公司。SDSPAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon-5200）購(gòu)自上海天能科技有限公司；低溫高速離心機(jī)（3k30）購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 以含DMEM高糖、10%胎牛血清（FBS），加入1%青霉素G 100 U/mL、鏈霉素100 g/L雙抗的培養(yǎng)基中培育H9c2大鼠心肌細(xì)胞，于恒溫37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%，使用胰酶消化離心后，將細(xì)胞以2.0×105個(gè)/mL接種在6孔板中繼續(xù)孵育，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2尿酸母液及各濃度抑制劑制備 將尿酸溶至0.5 mol/L NaOH中，制備成15 g/L的母液，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋即可。NAC（抗氧化劑）制備為5 mmol/L，PD98059（ERK抑制劑）制備為20 mmol/L，SB203580（P38抑制劑）制備為100nmol/L，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組（Con組）、高尿酸組（HUA組）、抗氧化劑組（NAC組）、ERK抑制劑組（PD98059組）、P38抑制劑組（SB203580組）、高尿酸+抗氧化劑組（NAC+HUA組）、高尿酸+ERK抑制劑組（PD98059+HUA組）、高尿酸+P38抑制劑組（SB203580+HUA組）以及高尿酸+抗氧化劑+ERK抑制劑組（NAC+PD98059+HUA組）。Con組不作任何處理，加入等量的培養(yǎng)基，HUA組將心肌細(xì)胞與0.15 g/L尿酸在新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育24 h，NAC組加入5mmol/L的NAC預(yù)處理30 min，PD98059組加入20 mmol/L的PD98059預(yù)處理30 min，SB203580組加入100 nmol/L的SB203580預(yù)處理30 min，NAC+HUA組在加入尿酸作用前，使用5 mmol/L的NAC預(yù)處理30 min，PD98059+HUA組在加入尿酸作用前，使用20 mmol/L的PD98059預(yù)處理30 min，SB203580+HUA組在加入尿酸作用前，使用100 nmol/L的SB203580預(yù)處理30 min，NAC+PD98059+HUA組在加入尿酸作用前同時(shí)加入5 mmol/L的NAC和20 mmol/L的PD98059預(yù)處理30 min，收集細(xì)胞用于生物化學(xué)或分子測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4MTT法測(cè)定H9c2心肌細(xì)胞的活力 將細(xì)胞以4 000個(gè)/孔接種到96孔板中，分別以0、0.05、0.10、0.15 g/L的尿酸量及不同的作用時(shí)間（12、24、48和72 h）對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行處理，以確定最佳尿酸實(shí)驗(yàn)水平及作用時(shí)間；待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基并向每個(gè)孔中加入150 μL MTT溶液（0.5 g/L）并在37℃下孵育4 h。除去MTT溶液并加入150 μL DMSO使紫色結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)量各孔OD值，以O(shè)D值大小代表細(xì)胞活力情況，將處理細(xì)胞的光密度標(biāo)準(zhǔn)化，并與對(duì)照細(xì)胞（0 g/L）的光密度進(jìn)行比較，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)6孔板（2.0×105個(gè)/孔），使其貼壁后，使用高尿酸0.15 g/L處理24 h，NAC、NAC+HUA組在高尿酸作用前30 min預(yù)處理同1.2.3，高尿酸處理后棄去培養(yǎng)基，使用10 mmol/L DCFH-DA對(duì)心肌細(xì)胞染色，在37℃環(huán)境下作用30 min，然后通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)Con組、HUA組、NAC組及NAC+HUA組染色的細(xì)胞進(jìn)行成像，并使用流式細(xì)胞儀（激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm和480 nm）對(duì)染色細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，得出細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，表示細(xì)胞的氧化壓力，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.6Western blot檢測(cè)ERK及P38的蛋白表達(dá)水平 將細(xì)胞裂解液（RIPA）加入蛋白酶抑制劑（1 mmol/L苯甲烷磺酰氟，PMSF）和磷酸酶抑制劑（磷酸酶抑制劑混合物I）混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中裂解30 min，收集細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，12 000 r/min離心15 min，最后棄沉淀，取上清液。通過(guò)使用BCA法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度，然后將余蛋白樣品加4×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100℃變性5 min。取適量蛋白樣品在10%SDS-PAGE分離蛋白（60 V 40 min，110 V 55 min），濕轉(zhuǎn)（200 mA，90 min）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶阻斷其他非特異性蛋白，孵育一抗過(guò)夜，P-ERK（1∶1 000），P-P38（1∶1 000），T-ERK（1∶1 000），T-P38（1∶1 000），GAPDH（1∶10 000），然后孵育二抗1 h（1∶10 000），抗原抗體結(jié)合完畢后，使用ECL顯影液曝光，最后通過(guò)使用數(shù)字圖像處理系統(tǒng)獲得Western blot圖像，并使用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高尿酸對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響 經(jīng)高尿酸處理后，心肌細(xì)胞活力呈劑量依賴(lài)性下降趨勢(shì)，且在尿酸為0.15 g/L時(shí)，細(xì)胞活力在各時(shí)間點(diǎn)較其他劑量下降最為明顯。0.15 g/L尿酸處理不同作用時(shí)間，細(xì)胞活力在24 h和48 h分別降低21%和32%，見(jiàn)圖1，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取0.15 g/L尿酸為最佳實(shí)驗(yàn)劑量。

2.2 高尿酸處理對(duì)心肌細(xì)胞ROS的影響 Con組、HUA組、NAC組、NAC+HUA組氧氣壓分別為11.650±3.977、55.300±9.069、8.300±1.985及26.300±4.060，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=4，F(xiàn)=61.980，P＜0.01），HUA組的氧化壓力較Con組明顯上升，而NAC+HUA組的氧化壓力較HUA組下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 各組心肌細(xì)胞活力比較 與Con組相比，HUA組心肌細(xì)胞活力水平明顯下降（P＜0.05），而與HUA組相比，NAC+HUA組、PD98059+HUA組及SB203580+HUA組的心肌細(xì)胞活力均上升（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ERK及P38表達(dá)比較 與Con組比較，HUA組ERK的磷酸化水平明顯增加（P＜0.05），與HUA組相比，NAC+HUA組、PD98059+HUA組、NAC+PD98059+HUA組ERK的磷酸化水平明顯下降（P＜0.05）；與Con組比較，HUA組P38的磷酸化水平明顯增加（P＜0.05），與HUA組相比，NAC+HUA組、PD98059+HUA組、NAC+PD98059+HUA組、SB203580+HUA組P38的磷酸化水平明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Fig.1 The activity levels of cardiomyocytes detected by MTT assay圖1 MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力水平

Fig.2 Results of immunofluorescence staining and flow cytometry for intracellular ROS levels圖2 免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平

Fig.3 The activity levels of cardiomyocytes detected by MTT assay in each group圖3 MTT法測(cè)定各組心肌細(xì)胞活力水平

Fig.4 The expressions of ERK and P38 phosphorylated protein in cardiomyocytes detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中ERK、P38磷酸化蛋白表達(dá)情況

3 討論

高尿酸作為代謝性疾病受到越來(lái)越多的關(guān)注，2018年歐洲《高尿酸血癥和高心血管病風(fēng)險(xiǎn)患者的診斷和治療專(zhuān)家共識(shí)》提出，高尿酸血癥與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)，可預(yù)測(cè)心血管病死亡、高血壓或糖尿病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)［10］，表明高尿酸血癥完全有可能直接通過(guò)影響心肌細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)采用高尿酸刺激H9c2細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停Y(jié)果發(fā)現(xiàn)與Con組相比，高尿酸刺激后細(xì)胞活力明顯降低，且刺激了ROS的生成。ROS是當(dāng)細(xì)胞受到有害刺激時(shí)發(fā)生異常代謝所產(chǎn)生的，它作為第二信使在多種靶細(xì)胞中介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、壞死、凋亡和分化等過(guò)程［11］。Zhang等［12］發(fā)現(xiàn)高尿酸能引起心肌細(xì)胞內(nèi)ROS增加并激活NLRP3炎性小體，進(jìn)而引起心肌損傷。Sun等［13］也發(fā)現(xiàn)高濃度的尿酸可直接引起雞的心肌細(xì)胞的氧化損傷。本研究中在高尿酸刺激下，大鼠心肌細(xì)胞的氧化壓力明顯增加，ROS水平明顯回升，而在NAC+HUA組中，氧化壓力較HUA組明顯降低，細(xì)胞活力水平明顯上升，表明高尿酸可以直接作用于心肌細(xì)胞，并引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激如何進(jìn)一步影響心肌細(xì)胞活力，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)激活ERK及P38通路相關(guān)。

MAPK通路是細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、分化、功能同步化、轉(zhuǎn)化、凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同交匯通路之一，可將胞外信號(hào)經(jīng)受體、G蛋白/小G蛋白、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)傳遞到胞內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等，不同的生長(zhǎng)刺激、應(yīng)激刺激，在不同的細(xì)胞，經(jīng)不同細(xì)胞骨架局限的不同信號(hào)通路，可產(chǎn)生多種效應(yīng)［13］。而ERK和P38是MAPK中的兩條關(guān)鍵的信號(hào)通路，ERK廣泛存在于各種組織中，參與細(xì)胞增殖分化的調(diào)控，而P38則介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的炎癥、凋亡等過(guò)程［14］。有研究表明，細(xì)胞應(yīng)激下產(chǎn)生的ROS可激活ERK和P38信號(hào)通路，進(jìn)而影響靶細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等［15-16］。為闡明ERK和P38通路是否參與了高尿酸抑制心肌細(xì)胞活力的過(guò)程，本研究建立了ERK抑制劑+高尿酸（PD98059+HUA）組及P38抑制劑+高尿酸（SB203580+HUA）組，發(fā)現(xiàn)其與HUA組相比，心肌細(xì)胞活力有所恢復(fù)，表明ERK及P38可能參與了高尿酸抑制心肌細(xì)胞活力的過(guò)程，這也與Zha等［17］發(fā)現(xiàn)高尿酸在腎小管細(xì)胞通過(guò)氧化應(yīng)激激活ERK通路的結(jié)果一致；進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)到與Con組相比，HUA組的ERK和P38的磷酸化水平明顯增加，與HUA組相比，PD98059+HUA組的ERK和P38的磷酸化水平明顯下降，SB203580+HUA組的P38磷酸化水平也明顯下降，表明心肌細(xì)胞在高尿酸刺激下，激活了ERK和P38 MAPK信號(hào)通路。因此，高尿酸刺激后，心肌細(xì)胞的活力下降與ERK和P38 MAPK信號(hào)通路的激活密切相關(guān)，這可能是高尿酸引起心肌損傷的機(jī)制之一。

綜上所述，高尿酸可以引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，激活ERK和P38 MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞活力。不少研究表明心肌在受到缺血再灌注等有害刺激時(shí)，也同樣會(huì)激活ERK通路［13，18］。這與本研究中高尿酸作為一種有害刺激作用于心肌細(xì)胞時(shí)，引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而激活ERK信號(hào)通路是一致的。而使用NAC、ERK抑制劑及P38抑制劑干預(yù)后均可明顯逆轉(zhuǎn)高尿酸對(duì)心肌細(xì)胞活力的抑制，保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。因此早期阻斷這一過(guò)程可能有助于改善高尿酸血癥相關(guān)代謝性心臟病的預(yù)后。