電針調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β及胰島素抵抗的機(jī)制研究*

金奉奎，李 瑞△，曹昺焱，宋姍姍，張婧怡，金永祚

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

2型糖尿病是以高血糖和脂肪代謝紊亂為特征的慢性代謝性疾病。是以全身代謝紊亂以及干預(yù)心血管、神經(jīng)、眼，腎臟等重要器官的多種并發(fā)癥為其主要臨床表現(xiàn)的一種疾病。其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，病因可能是多源性的。糖尿病的發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國有1.14億糖尿病患者[1]。新近臨床流行病學(xué)研究顯示[2]，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)病率較高，占全部糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患者的90%。2型糖尿病與人口老齡化、生活水平改善等社會變化所致肥胖人群的增加有關(guān)。該病除了嚴(yán)重危害患者健康外，還給中國政府和患者帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有研究顯示[3]，2型糖尿病及其并發(fā)癥的治療給中國造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，直接醫(yī)療總費(fèi)用占衛(wèi)生總費(fèi)用的3.94%，其中并發(fā)癥的治療成本占總直接醫(yī)療支出的81%。

胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是2型糖尿病形成的關(guān)鍵[4]。胰島素抵抗是正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，也即胰島素生物作用的貶值。表現(xiàn)為外周組織對胰島素的敏感性下降，影響葡萄糖的利用障礙?，F(xiàn)代研究表明[5]，胰島素抵抗主要由遺傳及環(huán)境因素共同引起，與肥胖、慢性高血糖、高血脂、炎癥標(biāo)志物及細(xì)胞因子等多種因素有關(guān)。其中炎性因子與胰島素抵抗有密切相關(guān)性。有研究者[6]應(yīng)用炎癥評分發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的炎性因子水平均增加，一些炎性因子參與了胰島素抵抗的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過對2型糖尿病大鼠電針干預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察其血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)水平變化，為臨床研究治療該病提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為7只體質(zhì)量140～160 g(2月齡)的SPF級雄性Zucker Lean[ZL(fa/+)]大鼠以及14只同月齡SPF級雄性Zucker Diabetic Fatty[ZDF(fa/fa)]大鼠[北京維通利華公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006]。動物于23 ℃、空氣流通、相對濕度60%、12 h晝夜循環(huán)光照的條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)于1周誘導(dǎo)飼養(yǎng)后開始進(jìn)行，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，如無特殊需要，動物自由飲食水，喂食普通飼料。

1.2 動物分組及模型制備

全部大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按ZDF大鼠說明書要求，以Purina#5008飼料喂養(yǎng)4周，誘導(dǎo)ZDF大鼠高血糖癥狀；其后以空腹血糖及OGTT2h血糖均>11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。成模的ZDF大鼠依空腹血糖排序隨機(jī)區(qū)組分為：模型組7只、電針組7只，雄性ZL大鼠作為空白組7只，分別進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)。干預(yù)期間，全部動物均以Purina#5008飼料喂養(yǎng)(組成：粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纖維≤4.0%，粗灰分≤10%，水分≤11.0%，磷≥0.65%，鈣0.75%～1.25%；原料組成：玉米粉，脫殼大豆粉，小麥粉，魚粉，麥麩，啤酒酵母，蔗糖蜜，麥芽，甜菜粉，燕麥粉，大豆粉，脫水苜蓿草粉，大豆殼粉，礦物質(zhì)和維生素)。

1.3 實(shí)驗(yàn)耗材

羅氏ACCU-CHEK血糖儀(LOT 1012977，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);羅氏血糖試紙(LOT 2468543，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);中研太和牌針灸針0.13 mm×7 mm(21216112，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);電針儀器;1.5 mL及5 mL注射器等。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 空白組及模型組 不干預(yù)。

1.4.2 電針組 將動物固定于可伸出四肢的棉布鼠套靜置5 min，以0.13 mm×7 mm針灸針針刺雙側(cè)“足三里”“三陰交”“脾俞”“胃脘下俞”，進(jìn)針得氣后行平補(bǔ)平瀉手法，并連通電針儀(電針一端連接于“胃脘下俞”，一端連接同側(cè)“足三里”，形成回路)，連續(xù)波，頻率15 Hz，電流輸出強(qiáng)度2 mA，留針25 min，每周6次(周一至周六)，4周。以上各種干預(yù)操作均于每日13：00—18：00期間進(jìn)行，連續(xù)干預(yù)4周。于干預(yù)第1、第4周周六晚20：00禁食，周日早8：00檢測空腹血糖。

1.5 取材及指標(biāo)檢測

1.5.1 空腹血糖、TNF-α、IL-6、ZL-1β及血清胰島素抵抗指數(shù) 所有動物于全部干預(yù)結(jié)束后，自由飲食水，當(dāng)晚22：00禁食，次日早8：00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5～10 mL離心管中，室溫靜置凝固后，于4℃條件下3 000 r/min離心15 min分離血清。以放射免疫法測血清血糖、TNF-α、IL-6 、IL-1β及血清胰島素抵抗指數(shù)。

胰島素抵抗指數(shù)：HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.5.2 IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白 所有模型大鼠于全部干預(yù)結(jié)束后，自由飲食水，當(dāng)晚22：00禁食，次日早8：00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，依據(jù)第4周干預(yù)后空腹血糖數(shù)據(jù)，每組隨機(jī)抽取，每樣本取材骨骼肌，取材樣本在-80℃急速冷凍保存，以蛋白印跡法測骨骼肌IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01認(rèn)為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較

經(jīng)干預(yù)后，電針組、模型組與空白組相比，電針組大鼠血清TNF-α水平明顯較高(P<0.05)；而電針組模型組相比血清TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電針組、模型組與空白組相比，血清IL-6水平明顯較高(P<0.05)；而電針組與模型組相比，血清IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。電針組、模型組與空白組相比，血清IL-1β水平明顯較高(P<0.05)；而電針組與模型組相比血清IL-1β差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平比較

2.2 各組大鼠空腹血糖(FBG)水平比較

造模前電針組、模型組與空白組比較，空腹血糖明顯上升(P<0.05)，而電針組和模型組兩組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。干預(yù)第4周后，電針組、模型組與空白組相比，空腹血糖值升高(P<0.05)；電針組與模型組相比，血糖有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，比較均值評分顯示電針組有一定降糖效果。同組干預(yù)前后比較，模型組空腹血糖明顯升高(P<0.05);電針組血糖變化不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)前后空腹血糖(FBG)比較

2.3 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平比較

經(jīng)干預(yù)后，電針組、模型組與空白組相比，大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平明顯升高(P<0.05)；而電針組與模型組相比，血清胰島素抵抗指數(shù)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)水平比較

2.4 各組大鼠IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表達(dá)情況

電針組與空白組比較，大鼠骨骼肌IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表達(dá)有所提高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針組與模型組比較，大鼠骨骼肌IRS-1 Ser307蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而GLUT4蛋白表達(dá)明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖1。

圖1 各組大鼠IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠IRS-1 Ser307、GLUT4蛋白表達(dá)比較

3 討論

2型糖尿病屬中醫(yī)學(xué)中的“消渴”“消癉”范疇，中醫(yī)認(rèn)為糖尿病的病因?yàn)榉A賦不足、情志失調(diào)、飲食不節(jié)和勞欲過度等引發(fā)肺、脾、腎功能失調(diào)導(dǎo)致消渴，病機(jī)為燥熱偏盛、陰津虧損,多以陰虛為本、燥熱為標(biāo)。因此清熱潤燥、養(yǎng)陰生津?yàn)橹委熍c選穴原則。選取足三里、三陰交滋陰補(bǔ)腎、益氣生津、健脾益胃清熱外，結(jié)合電針刺激作用達(dá)到活血化瘀、清熱解毒功效，起到機(jī)體免疫功能調(diào)控[7-9]。選用背俞穴脾俞、胃脘下俞，《素問》云：“治臟者治其俞”，脾俞、胃脘下俞可發(fā)揮調(diào)暢臟腑經(jīng)氣、整體津液代謝調(diào)節(jié)、恢復(fù)陰陽平衡的功能。而且背俞穴深層為分布于脊柱兩側(cè)的交感神經(jīng)帶，具有調(diào)節(jié)對應(yīng)內(nèi)臟功能作用[10]。

胰島素通路途徑是首先胰島β細(xì)胞分泌胰島素，胰島素血液運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)的胰島素受體底物IRS，IRS-1酪氨酸磷酸化激活PI3K，激活后的PI3K可以催三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，其作為第二信使激活A(yù)KT，激活開啟PI3K-Akt-GLUT4，細(xì)胞表面激活GLUT4數(shù)量增多，增強(qiáng)葡萄糖的攝取能力，達(dá)到降血糖。其中，IRS-1的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(RIS-895)和絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(IRS-307)之間存在競爭關(guān)系，兩者處于此消彼長的趨勢。炎性細(xì)胞因子促進(jìn)絲/蘇氨酸磷酸化會競爭性地抑制酪氨酸磷酸化[11]，從而下調(diào)下游PI3K-Akt-GLUT4通路活性，減少骨骼肌在胰島素刺激下對葡萄糖的攝取，從宏觀上即表現(xiàn)為胰島素抵抗，說明炎性因子是導(dǎo)致胰島素抵抗的一個重要因素，其機(jī)理涉及炎性因子對IRS-1酪氨酸磷酸化的抑制作用。而炎性因子與2型糖尿病大血管并發(fā)癥有密切關(guān)系[12-13]，即胰島素抵抗后炎性因子在血循環(huán)中的濃度升高，作用于肝臟導(dǎo)致CRP合成增加[14]，CRP水平與2型糖尿病大血管病變發(fā)生正相關(guān)[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模前后電針組、模型組與空白組相比，血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β和空腹血糖水平出現(xiàn)明顯升高趨勢，干預(yù)結(jié)束后，電針組與模型組相比，電針可有效降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)后電針組與模型組比較，電針組的骨骼肌IRS-1 Ser307明顯下降(P<0.05)而GLUT4蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)，干預(yù)后電針組比模型組的空腹血糖(FBG)水平有所下降，干預(yù)結(jié)束后與模型組相比，電針組胰島素抵抗指數(shù)水平明顯下降(P<0.05)。提示2型糖尿病大鼠炎性因子可能與胰島素抵抗密切相關(guān)。

綜上所述，電針可降低2型糖尿病大鼠炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平，調(diào)節(jié) IRS-1 Ser307、GLUT4表達(dá)，其可部分解釋電針對IR以及2型糖尿病的作用機(jī)制及作用途徑。同時(shí)電針可降低空腹血糖(FBG)及胰島素抵抗指數(shù)水平，說明電針可控制2型糖尿病模型大鼠炎性因子水平，從而改善其胰島素抵抗?fàn)顩r及降低2型糖尿病的大血管病變,通過本實(shí)驗(yàn)證明電針起效的作用可能與其相關(guān)。