頭穴叢刺對焦慮模型小鼠HPAA軸作用及相關分子機制研究*

王 晨，鄭祖艷△，苗永新，張琳琳

(1.哈爾濱工業大學附屬黑龍江省醫院，黑龍江 哈爾濱 150036； 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

焦慮癥是以焦慮為主要特征的神經癥，根據《中國精神障礙分類與診斷標準》，焦慮癥可分為GAD和PD兩種類型[1]。臨床上以GAD為多見，主要表現為過度憂慮，伴失眠、易激惹、坐立不安，或感到緊張、易疲勞、注意力不能集中等。臨床藥物治療多采用選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)、三環類抗抑郁藥(TCA)及苯二氮卓類藥物等[2]。隨著人們對藥物治療焦慮癥導致副作用認知的深入，針刺治療焦慮癥的優勢逐漸顯現。頭穴叢刺法現已廣泛應用于治療精神障礙類疾病，但有關機理研究尚不確切，故本研究從頭穴叢刺治療焦慮模型小鼠HPAA軸及分子機制角度出發，進一步證明頭穴叢刺法對焦慮癥的治療作用，對臨床有重要的指導意義。

本實驗模擬人受到應激刺激的過程，從心理應激與生理應激兩方面選擇高架十字迷宮實驗(EPM)[3-4],與間氯苯哌嗪(mCPP)共同誘導焦慮模型小鼠，基于此探討頭穴叢刺對焦慮癥的治療效果及作用機理，從而為臨床治療提供理論和科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級8周雄性SD小鼠60只，體質量180～200 g，實驗動物由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心購買。室溫(20±2)℃，自由食、水飼養；適應環境1周后正式實驗。實驗遵照《實驗動物倫理與福利》等相關要求。

1.2 試劑與儀器

電子秤(天津醫療器械廠)，-70 ℃冰箱(日本日立公司)，安迪牌針灸針(0.25 mm×25 mm)，恒溫高速離心機(日立公司)，電針治療儀(鑫升實業有限公司)，BA200數碼三目顯微攝像系統(麥克奧迪公司)，Image-ProP-lus6.0圖像分析系統(MediaCy-bernetics公司)，十字迷宮視頻跟蹤系統(泰盟科技有限公司)[5]。

1.3 造模方法與分組

造模方法參照Bondi CO等的方法[6],將小鼠隨機分成3組，然后分別注射生理鹽水、mCPP 1 mg/kg、mCPP 2 mg/kg,20 min后將小鼠置于EPM的平臺處，使小鼠面對其中一個開放臂，釋放后開始記錄5 min內的以下指標：①OE(進入開臂次數)：以小鼠四爪均進入到臂內為準，一個爪子從該臂中完全退出則為結束；②OT(進入開臂時間)：單位為s；③CE(進入封臂次數)：標準同①；④CT(進入封臂時間)：單位為s；⑤OT%(開臂停留時間百分比)：開臂停留時間/總時間×100%；⑥OE%(進入開臂次數百分比)：進入開放臂次數/(OE+CE)×100%,并選擇OT%和OE%最高的40只小鼠。通過SPSS20.0統計學軟件對40只造模成功的小鼠進行隨機分組，其中20只進入針刺組、20只進入模型空白組，另選20只不造模、不針刺的小鼠設為空白對照組。

1.4 針刺方法

造模成功后，將針刺組小鼠固定，參照《實驗動物穴位圖譜》定位，在頂前區及頂區分別以前神聰、百會、后神聰為中心,取穴為前神聰及前神聰兩側各旁開1寸及2寸平行線,百會兩側各旁開0.5寸及1.5寸平行線,以及后神聰及后神聰兩側旁開1寸平行線,共12針呈楔形分布[7]，針刺方法為向后平刺快速進針，使針刺入小鼠頭皮下約20 mm，并迅速捻轉，每日1次，每次15 min,連續治療21 d，模型空白組與空白對照組同時進行與針刺組相同的固定，不進行針刺治療。

1.5 行為學測試方法

各組小鼠在實驗結束后第2天，再次進行EPM，即分別使3組小鼠面對其中一個開臂，釋放小鼠后記錄5 min內的OT%、OE%(具體行為學測試方法同造模方法)，經t檢驗進行統計。

1.6 取材及檢測方法

行為學測定完畢后，各組小鼠立即用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，每組隨機取鼠10只，經麻醉后取腦，分離小鼠下丘腦(含室旁核、杏仁核)，通過免疫組化法檢測各組小鼠下丘腦內CRH、ACTH、CORT和NPY含量。采用酶聯免疫法檢測血漿中CRH、ACTH和CORT含量。每組另取剩余10只小鼠，分離出下丘腦，低溫離心后取上層清液，應用RT-PCR技術檢測下丘腦中NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA水平。

1.7 統計方法

2 實驗結果

實驗造模及行為學測試過程中，各組小鼠無死亡。實驗過程中，針刺組小鼠死亡1只(因無法耐受針刺)，其他兩組小鼠實驗過程中無樣本損失。

2.1 各組小鼠EPM行為學復測比較

針刺組小鼠與模型空白組小鼠治療前OT%、OE%比較，差異無統計學意義(P>0.05)，兩組小鼠實驗前差異無統計學意義。針刺組小鼠試驗后與實驗前比較，OT%、OE%均有所提高(P<0.05);與模型空白組小鼠實驗后對比發現，針刺組OT%、OE%值升高顯著(P<0.05);模型空白組與空白對照組對比可發現，模型空白組小鼠的OT%、OE%值明顯下降(P<0.05)。EPM復測結果顯示，EPM試驗可使小鼠產生焦慮心理，且由于EPM實驗復測可信度高[8-10]，說明本實驗焦慮小鼠造模成功，且頭穴叢刺法可顯著改善小鼠的恐懼心理和焦慮行為。見表1。

表1 3組小鼠治療前后行為學測試結果比較

2.2 3組小鼠血漿CRH、ACTH和CORT含量比較

針刺組與模型空白組比較P<0.05，說明頭穴叢刺可改善小鼠血漿中CRH、ACTH和CORT的濃度。模型空白組與空白對照組相比，小鼠血漿CRH、ACTH和CORT濃度也發生明顯變化(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠血漿CRH、ACTH和CORT含量比較

2.3 3組小鼠下丘腦中CRH、ACTH、CORT和NPY含量比較

針刺組與模型空白組比較,差異有統計學意義(P<0.05)，說明頭穴叢刺可顯著改善模型小鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT和NPY的濃度。模型空白組與空白對照組比較，CRH、ACTH、CORT和NPY濃度也發生明顯變化(P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠下丘腦CRH、ACTH、CORT和NPY含量比較

2.4 3組NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA含量比較

針刺組與模型空白組對比，差異有統計學意義(P<0.05)，可見頭穴叢刺可明顯降低小鼠下丘腦中NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA含量，模型空白組與空白對照組比較，下丘腦中NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA濃度提高明顯(P<0.05)。見表4、圖1～2。

表4 3組小鼠下丘腦NPY受體Y1 mRNA、Y5 mRNA含量比較

注：1～3為針刺組，4～6為模型空白組，7～9為空白對照組。圖1 3組小鼠下丘腦NPY受體Y1 mRNA含量表達

注：1～3為針刺組，4～6為模型空白組，7～9為空白對照組。圖2 3組小鼠下丘腦NPY受體Y5 mRNA含量表達

3 討論

焦慮癥是指以反復發作的焦慮或驚恐不安為主要特點的神經障礙性疾病，典型表現為偶然或持續的恐懼或憂慮感且難以自控，自主神經癥狀也可伴隨出現[11-15]。中醫學將焦慮癥歸屬于“郁病”“奔豚氣”“心悸”等范疇[16]，如《素問·舉痛論》提到:“思則心有所存……故氣結矣”。認為七情所致的情志郁結為主要病機。現代醫學則認為焦慮癥的發生受HPAA軸所分泌的激素水平的影響。由下丘腦室旁核神經元分泌的ADH(抗利尿激素)和CRH(促腎上腺皮質激素釋放激素)，兩者進一步刺激ACTH(促腎上腺皮質激素)的釋放。ACTH也同時存在一條負反饋通路作用于下丘腦，在應激狀態如焦慮、精神緊張時可激活HPAA軸，促使CRH、ACTH分泌增加。而腎上腺中CORT含量可反映HPAA軸功能是否發生變化。當CORT含量明顯升高時對HPAA軸功能亢進有提示意義[17]。

頭穴叢刺法應用于臨床在治療各種情志病方面早已取得顯著療效[18-19]。但相關實驗研究結果比較匱乏，因此本實驗從行為學及分子機制角度出發，實驗結果表明頭穴叢刺組小鼠治療后行為學測試比較OT%、OE%均明顯高于模型空白組及空白對照組。而頭穴叢刺組小鼠血漿中CRH、ACTH、CORT含量及下丘腦中CRH、ACTH、CORT、NPY及其Y1 mRNA、Y5 mRNA受體含量在實驗結束后較模型空白組及空白對照組均有顯著改善。頭穴叢刺的原理從神經解剖角度而言其主要刺激區域為頂區及頂前區，頂前區臨近額葉，因此這兩個區域的病變極大程度上可導致精神癥狀的發作，頭穴叢刺法可以通過調節相應大腦皮層功能從而改善腦組織的病理狀態[20-22]。從選穴角度來看，頭穴叢刺針刺部位均在督脈巡行附近，“督脈者，起于下極之輸……入屬于腦。”腦為元神之府，是精神意識的主宰，督脈“入絡腦”，百會為督脈穴位，根據經脈所過、主治所及的原理，頭穴叢刺具有調理氣機、健腦益智和疏經通絡的作用，在治療神志病方面有很大的優勢。

因此，本實驗研究結果表明，頭穴叢刺具有通過抑制焦慮模型小鼠HPAA軸興奮性降低CRF的分泌、改善小鼠焦慮癥狀的效果，可作為證實頭穴叢刺治療焦慮癥有效的科學實驗依據，但因本實驗還存在某些不足之處，仍需進一步的實驗研究加以論證。