“醒腦開竅”針法對大腦中動脈閉塞大鼠不同時相ICAM-1、MMPs-9表達的影響*

王文秀,邱連利,劉 倩,丁凡帆,康曉文

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730000)

腦卒中因高發病率、高致殘率、高死亡率成為我國居民的主要死亡原因，而其中的缺血性腦血管類疾病又占全部腦血管疾病總數的60%～80%[1]，而細胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecules-1,ICAM-1)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMPs-9)在腦水腫發生中的作用逐漸受到重視，主要體現于腦出血后炎癥反應方面：當腦組織發生損傷時，血管內皮細胞隨之受損，通透性進而增加并產生凝血活性物質，導致內皮細胞呈現為促凝狀態，最終誘發血管出血及血栓，刺激ICAM-1、MMPs-9等炎癥因子異常增高[2]，使血管舒縮活性物質不能正常表達，致使血管異常收縮，使腦缺血和卒中危險系數增大。對于缺血性腦受損來說，選擇針灸方案進行醫治存在著多路徑、多成效、多靶點維護及干預的特征，能夠限制局部病灶的擴散范圍、促進腦組織循環及腦組織氧代謝、提離腦血流量與腦部對缺氧的可耐受程度。石學敏[3]醫治中風3 207例,初次發病2 523例,治愈1 489例,治愈率達59.%,總有效率98.97%,而多次發病者684例,治愈322例,治愈率47.07%,總有效率為96.64%。因而可見,越是初期利用醒腦開竅針法治療,其療效就越明顯;若是醒法治療介入時機越晩,則中風病的致殘率就越高。有研究[4]發現治療后針灸治療組神經功能缺損改善情況明顯優于西醫常規治療組,并具備惡化率低的優勢。針刺治療因副作用小、效果顯著、癥狀恢復穩定而愈來愈被普遍地應用到腦卒中后的醫治體系中。本實驗采用“醒腦開竅”針法，探討“醒腦開竅”針法對大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠不同時相間ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠144只,SPF級，來源：甘肅中醫藥大學實驗室，體質量(280±20)g。實驗動物生產許可證號：SCXK[甘]2015-0002；實驗設施許可證號SYXK[甘]2015-0005。隨機分為：腦缺血再灌注損傷模型組(對照組)、醒神開竅針法組(實驗組)，再按照灌注4 h、缺血1 d、7 d、20 d各分為4個亞組，每組18只大鼠。

1.2 造模方法

采用由Longa等[5]改進的大腦中動脈二次線栓法。大鼠稱體質量，按3.3 mL∶100 g藥鼠比例,腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，待折屈大鼠尾部無反應即為麻醉成功，麻醉后仰臥固定于大鼠板上頸部剃毛，碘伏消毒后偏頸部右側做一切口，鈍性分離出右側頸總動脈(CCA)，此時可張開直鑷擴大分離，在CCA近心端掛線備用，鈍性分離頸外動脈(ECA)直至距離其與頸內分叉處遠心端1 cm處，分離并掛線結扎ECA遠心端，在近分叉處縫合掛線備用。鈍性分離頸內動脈(ICA)和ICA的顱外分支-翼腭動脈。將ICA、CCA遠心端用動脈夾夾閉，在距離分叉處遠心端0.5 cm處將ECA用眼科剪剪一小口，插入碳素魚線，減去多余縫合線，縫合皮膚,同時予青霉素鈉肌注。造模后大鼠神經功能缺損評分為1～3分者,且處死后取腦可見大鼠腦梗塞灶位于缺血顳葉,此為大腦中動脈供血區域,代表實驗大鼠造模成功。

1.3 針刺方法

選用“醒腦開竅”針刺法之主穴雙“內關”“人中”。選穴根據《實驗針灸學》[6]《大鼠穴位圖譜的研制》[7],模擬人體腧穴骨度分寸法量取兩穴。大鼠不麻醉，仰臥，大鼠腹部套封在塑制100 mL氯化鈉輸液瓶后固定，然后將四肢及頭部固定在大鼠架上，采用華佗牌0.30 mm×0.25 mm規格針，先刺內關，并于兩內關穴接電針治療儀，疏密波(頻率2 Hz)，刺激程度以雙上肢輕微抖動為宜；人中穴留針10 min，內關兩穴留針20 min。

1.4 檢測指標

1.4.1 神經缺損行為體征與評分 采用Z-Longa法對各組實驗大鼠進行神經功能評分，每次評分3次，求其平均值。評為4分：意識昏迷或者不能行走；評為3分:重度神經功能缺陷,向手術對側傾倒；評為2分:中度神經功能缺陷,向手術側的對側轉圈；評為1分：輕度神經功能缺損,表現為不能完全伸展手術對側前爪。

1.4.2 腦組織ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA的表達 取兩組大鼠的各個時間點，將各組6只大鼠在相應的時相點取材：用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g體質量)腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，快速沿左側胸骨柄剪開肋骨，開胸暴露心臟，于右心耳剪開一小孔，迅速穿刺左心室，用50 mL注射器吸取37 ℃生理鹽水灌注(灌注壓為100 mmHg)，重復多次，致右心耳流出無色清亮液體，以清除血液中的染料，開顱取腦。對大腦(左側)缺血組織進行逆轉錄聚合酶鏈法分析。Trizo(YESEN)試劑提取腦組織總RNA，經逆轉錄、擴增(試劑盒為TaKaRa產品)步驟取PCR擴增產物進行電泳實驗，電泳結果用凝膠圖像分析系統進行分析，反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，確認得出數據的可信性。計算mRNA的相對表達量F=2-△△ct，平均數、標準差及P值。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

實驗組和對照組兩組大鼠術后即評定神經功能缺損癥狀，再灌注4 h、1 d、7 d到20 d，分別在相應時間點進行評分，結果顯示，隨著時間的延長，神經功能缺損評分逐漸減少，可以推測隨時間的延長各組的神經功能有所恢復，評分逐漸下降，但實驗組下降明顯高于對照組，20 d兩者的評分差異有統計學意義(P<0.05),見表1。由此可知：針刺可以有效改善腦缺血再灌注損傷后大鼠局灶性神經功能缺損癥狀，促進神經功能損傷的恢復。

表1 兩組大鼠不同時間點神經功能缺損評分

2.2 各組大鼠ICAM-1 mRNA、MMPs-9 mRNA表達比較

大鼠造模后4 h、1 d、7 d及20 d，實驗組與對照組相比較，實驗組相應時間點ICAM-1表達均小于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05),見表2，pcr溶解曲線及擴增曲線分別見于圖1、圖2；大鼠造模后4 h、1 d、7 d及20 d，實驗組與對照組相比較，實驗組相應時間點MMPs-9表達均小于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05),見表3，pcr溶解曲線及擴增曲線分別見于圖3～4。

表2 兩組MCAO大鼠不同時相ICAM-1 mRNA表達

表3 兩組MCAO大鼠不同時相MMPs-9 mRNA表達

圖1 ICAM-1Real-time溶解曲線

圖2 ICAM-1Real-Time擴增曲線

圖3 MMPs-9Real-time溶解曲線

圖4 MMPs-9Real-Time擴增曲線

3 討論

經過大量查閱文獻筆者選擇體質量為(280±20)g的SD大鼠作為研究對象，原因如下：第一，體質量過小(<250 g)的大鼠對于麻藥耐受性比較差，增加了死亡率，而且體質量較小的大鼠血管也較細，導致碳素魚線難以插入；第二，體質量過大(>300 g)的大鼠血管變異的可能性大大增加，會使手術難度增加；第三，體質量>300 g的大鼠血管相應要粗很多，MCA的血流不能被線栓充分阻斷，從而導致造模成功率下降。除此之外，性別對于該模型的影響不容小覷，筆者選擇雄性大鼠是由于已有研究表明[7]，雌激素對神經具有保護作用，且雌激素的分泌具有周期性，而目前的技術尚不能準確計算雌激素水平，即實驗干預因素不可控，而雄激素的分泌周期并不顯著且對神經生理指標無太大影響。故體質量為(280±20)g的雄性SD大鼠更適合MCAO模型的制備。在前期造模預實驗過程中，筆者發現盡管線栓已完全且順利插入，但并未出現神經功能缺損癥狀，對此類造模不成功的大鼠進行解剖發現，是由于個別大鼠血管變異，需要插入線栓的深度與理論有一定的差距；另有大鼠在麻醉清醒時評分達3分,卻于次日或隔日死亡，解剖發現大鼠顱底可見血凝塊，推測由于線栓過程中手法太重，造成了蛛網膜下腔出血，因此在此實驗過程中，不僅要明確實驗動物的選擇，亦要對造模插線的手法及時間予以精確掌握。本實驗之所以選用MMPs-9、ICAM-1兩個炎癥因子作為觀察指標是因為近年來，隨著對腦缺血損傷機制的研究愈加深入，進行的相關研究亦隨之表明，炎癥因子的產生和發生作用是腦缺血損傷時的重要病理環節，因炎癥因子會導致腦組織代謝異常，引起神經元損傷和凋亡[8]。ICAM-1能夠在血管內皮細胞上表達，在炎性細胞因子以及內毒素等物質的刺激下表達率大幅度升高,當腦發生損傷時，TNF-α mRNA的表達會增加,進而對組織造成損傷，具體的機制：血管內皮細胞受損，通透性增加并產生凝血活性物質，導致內皮細胞表現為促凝狀態，最終誘發血管出血及血栓[9]；刺激ICAM-1異常增高,使血管舒縮活性物質不能正常表達，致使血管異常收縮，進一步使得腦缺血以及局部卒中的危險系數增加；觸發神經細胞凋亡機制導致細胞凋亡;而MMPs來源于血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞以及內皮細胞中，其中與腦缺血及再灌注密切相關的主要為明膠酶A(MMP-2)、明膠酶B(MMP-9)。這兩種MMPs被激活或活性上調，導致血腦屏障結構破壞，功能損傷，繼而引起腦水腫和出血[10-11]。本實驗中缺血再灌注損傷后4 h時，實驗組、對照組大鼠腦組織MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA已大量表達，再灌注1 d時兩組大鼠的兩種炎癥因子表達到最高峰，7～20 d，隨時間的延長，兩組大鼠腦組織MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA表達逐漸降低，且實驗組低于對照組(P<0.05)；再灌注20 d時，實驗組大鼠腦組織MMPs-9 mRNA、ICAM-1 mRNA的表達明顯低于對照組(P<0.05)。因此，本實驗證明，“醒腦開竅”針法可以通過抑制血清及腦組織中炎癥因子ICAM-1、MMPs-9的表達，從而發揮對腦組織的保護作用，并且針刺時間越早、周期越長，其療效也就越明顯。但在腦缺血損傷過程中，影響血腦屏障的因素很多，本實驗中筆者所涉及檢測到的指標有限，然而體內微環境復雜，“醒腦開竅”針刺療法是否通過其他方式減輕腦損傷，這些問題都需要在后續的研究中以待完善。