外源性HMGN2入胞并抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲

尹 佳 徐恩杰 馬 驍 周許輝

骨肉瘤是一種源自間充質(zhì)細胞的惡性骨腫瘤疾病，是兒童和青少年中最常見的惡性腫瘤之一[1]。骨肉瘤的特點是易早期轉(zhuǎn)移，約15%～25%的患者在確診骨肉瘤時可檢測到肺部轉(zhuǎn)移[2]。骨肉瘤的主要治療方法為腫瘤切除術(shù)和非特異性聯(lián)合化療[3,4]。隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤患者的長期生存率有所提高，但合并遠處轉(zhuǎn)移的患者其生存率仍非常低[5,6]。尋找新的、更有效的骨肉瘤治療靶點以降低腫瘤轉(zhuǎn)移、改善患者的生存時間成為研究的重點。

HMGN2的異常表達與多種腫瘤相關(guān)[7,8]。HMGN2在乳腺癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，能抑制膀胱癌細胞和口腔鱗狀細胞癌細胞的生長并促進腫瘤細胞凋亡[9～13]。筆者之前的研究表明，在骨肉瘤細胞中以感染慢病毒的方式過表達HMGN2會抑制細胞的轉(zhuǎn)移[14]。但目前慢病毒尚無法應(yīng)用于臨床治療。

研究表明，某些細胞可以往細胞外分泌HMGN2[15]。筆者推測釋放的HMGN2也具有抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的功能。此外，目前還沒有研究解釋HMGN2抗腫瘤功能的機制。本研究探索外源性HMGN2能否進入骨肉瘤細胞并抑制細胞的遷移和侵襲，并進一步探討HMGN2在骨肉瘤細胞中的抗腫瘤機制。

材料與方法

1.材料：U-2 OS骨肉瘤細胞和HEK 293FT細胞購自中國科學(xué)院細胞庫。慢病毒載體以及病毒包裝質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶、SYBR-Green預(yù)混液購自日本TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，NE-PER核蛋白提取試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，DMEM購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，McCoy′s 5a培養(yǎng)基、TRIzol試劑、Lipofactamine 2000、青霉素、鏈霉素購自美國Invitrogen公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，牛血清白蛋、flag M純化試劑盒、DAPI、結(jié)晶紫染色液購自美國Sigma-Aldrich公司，一抗及ELISA試劑盒購自英國Abcam公司，二抗購自美國CST公司，ECL曝光液購自美國Pierce公司，Trasnwell小室購自美國Coring公司。

2.細胞培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基包含10%胎牛血清(FBS)、青霉素 (100U/L)和鏈霉素(100mg/L)。McCoy′s 5a培養(yǎng)基包含15% FBS、青霉素 (100U/L) 和鏈霉素 (100mg/L)。筆者選擇兩個骨肉瘤細胞系用于后續(xù)實驗。將U-2 OS 骨肉瘤細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將Saos-2 骨肉瘤細胞在McCoy′s 5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Saos-2細胞中重復(fù)從U-2 OS細胞實驗中得到的遷移和侵襲的實驗結(jié)果。將HEK 293 FT細胞在DMEM中培養(yǎng)。所有細胞均置于含5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.HMGN2的過表達和蛋白純化：過表達慢病毒載體購自上海吉凱公司(GV492，元件順序：Ubi-MCS-3flag-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，中國上海)。用過表達慢病毒(HMGN2-flagoe組)和空白慢病毒(oeCON組)感染293FT細胞。通過預(yù)實驗確定U-2 OS細胞病毒感染的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，Saos-2的MOI為15，并基于該MOI值進行了正式實驗。為了增加陽性細胞的比例，在細胞感染3天后進行流式分選，并繼續(xù)培養(yǎng)帶綠色熒光的細胞。當(dāng)細胞培養(yǎng)至70%～80%融合率時，收集細胞并提取RNA，并通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)確認過表達效率。在確認HMGN2的過表達效率后，收集過表達HMGN2的細胞并使用NE-PER核蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)提取核蛋白，并應(yīng)用flag M純化試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)純化HMGN2-flag蛋白。通過ELISA(ab49763，英國Abcam公司)確認HMGN2的濃度。

4.實時熒光定量PCR(RT-qPCR)：以SYBR-Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)和ABI Prism 7900HT(美國Applied Biosystems公司)進行RT-qPCR，以定量測定HMGN2、MMP-2、MMP-9、MMP-16的表達水平。應(yīng)用TRIzol(美國Invitrogen公司)提取每組細胞的總RNA，使用Reverse Transcription試劑盒(美國Applied Biosystems公司)將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用特異性引物擴增基因，人β-actin基因為內(nèi)參。使用的PCR引物序列為以下：HMGN2：正向引物：5′-CGATTGTCTGCCCATGTCCT-3′，反向引物：5′-GCAGAACGTACCCTGTTCCA-3′; MMP-2：正向引物：5′-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3′，反向引物：5′-GGTCACATCGCTCCAGACT-3′; MMP-9：正向引物：5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，反向引物：5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′; MMP-16：正向引物：5′-AGCACTGGAAGACGGTTGG-3′，反向引物：5′-CTCCGTTCCGCAGACTGTA-3′; β-actin：正向引物：5′-ACCGAGCGCGGCTACAG-3′，反向引物：5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。采用2-ΔΔCt法分析并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。用相同的樣品和相同的引物重復(fù)RT-qPCR實驗3次。

5.Western blot法檢測：使用NE-PER核蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)提取核蛋白，并使用蛋白質(zhì)提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取總蛋白，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白濃度。獲得的蛋白溶液在SDS-PAGE凝膠上電泳，分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國Millipore公司)上，并在5%牛血清白蛋白(BSA，美國Sigma-Aldrich公司)中封閉。用對應(yīng)的一抗在4℃下孵育過夜。使用的抗體如下：抗HMGN2(1∶1000稀釋，ab199679，英國Abcam公司)，抗DDDDK(1∶1000稀釋，ab49763，英國Abcam公司)、抗MMP2(1∶500稀釋，ab97779，英國Abcam公司)、抗MMP9(1∶1000稀釋，ab76003，英國Abcam公司)、抗MMP16(1∶500稀釋，ab73877，英國Abcam公司)、抗LMNB1(1∶10000稀釋，ab16048，英國Abcam公司)、抗β-actin(1∶10000稀釋，ab8226，英國Abcam公司)。然后在室溫下用二抗孵育膜1h。使用ECL曝光液(No.32106，美國Pierce公司)顯影，并進行觀察、拍攝。

6.免疫細胞化學(xué)：用濃度為10μg/ml的純化HMGN2蛋白處理骨肉瘤細胞24h，然后將細胞用4%多聚甲醛固定30min，用0.1%Triton X-100的PBS溶液透化5min， 用1%BSA封閉細胞2h。將細胞在抗DDDDK抗體(1∶100稀釋，ab49763，英國Abcam公司)中4℃孵育過夜。然后將細胞在帶紅色熒光的二抗(美國Cell Signaling Technology公司)中孵育1h， PBS洗滌后用DAPI(美國Sigma-Aldrich公司)封固。觀察HMGN2-flag的細胞定位并使用共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)拍攝。

7.劃痕試驗：在HMGN2-flag組中，用濃度為10μg/ml的純化HMGN2-flag蛋白處理骨肉瘤細胞24h。對照組(UT組)加入等量的蛋白純化洗脫緩沖液。之后將兩組骨肉瘤細胞接種在6孔培養(yǎng)板中并生長至90%融合率。使用200μl微量移液管尖端建立劃痕，監(jiān)測細胞向劃痕中心的遷移并拍照。遷移率(%)=(S0h-S24h或S48h)/ S0h×100%。S0h是建立的劃痕寬度，S24h或S48h是建立劃痕24h或48h后的寬度。

8.Transwell侵襲試驗：細胞預(yù)處理方式同劃痕試驗。在6.5mm Transwell中測定細胞的侵襲能力差異。上室用涂覆50μl稀釋的基質(zhì)膠，下室加入500μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(或含有15%FBS的McCoy′s 5a培養(yǎng)基)。將細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中并加入上室中。將細胞培養(yǎng)24h，除去未侵襲的細胞。用4%多聚甲醛固定侵襲細胞30min，然后用結(jié)晶紫染色液染色。計數(shù)侵襲細胞并統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

1.HMGN2蛋白過表達與純化：HMGN2過表達慢病毒質(zhì)粒測序結(jié)果顯示序列正確(圖1A)。以慢病毒感染的方式在293FT細胞中過表達HMGN2，RT-qPCR結(jié)果顯示HMGN2-flagoe組HMGN2-mRNA的表達水平顯著高于oeCON組(圖1B)。提取兩組細胞的核蛋白，oeCON的總核蛋白為oeCON組，HMGN2-flagoe組的核蛋白利用flag標(biāo)簽進一步純化，獲得的純化蛋白為HMGN2-flag組，通過Western blot法進行分析鑒定，結(jié)果顯示使用抗HMGN2抗體兩組中均檢測到條帶，且HMGN2-flag組的蛋白由于是攜帶flag標(biāo)簽的融合蛋白，其相對分子質(zhì)量較oeCON組稍大(圖1C)，使用抗DDDDK抗體在HMGN2-flag組和flag-BAP組中檢測到條帶，而在對照組中未檢測到條帶(圖1D)。

圖1 HMGN2蛋白過表達與純化A.HMGN2過表達慢病毒質(zhì)粒測序結(jié)果；B.RT-qPCR確認過表達效率；C.HMGN2-flag純化和Western blot法檢測。使用抗HMGN2抗體在HMGN2-flag組中檢測到HMGN2。D.使用抗DDDDK抗體在HMGN2-flag組和陽性對照flag-BAP組中檢測到條帶。flag-BAP.攜帶flag標(biāo)簽的融合蛋白，相對分子質(zhì)量為49.3kDa。oeCON組.oeCON組的核蛋白提取物;HMGN2-flag組.HMGN2-flagoe組的核蛋白經(jīng)純化后的帶flag標(biāo)簽的蛋白

2.外源性HMGN2轉(zhuǎn)運到骨肉瘤細胞和細胞核中：用濃度為10μg/ml的純化HMGN2-flag蛋白處理骨肉瘤細胞24h，通過免疫細胞化學(xué)檢測外源蛋白的細胞定位。結(jié)果顯示，真核細胞表達的HMGN2可在處理24h后轉(zhuǎn)運到骨肉瘤細胞的細胞核中(圖2)。

圖2 免疫細胞化學(xué)實驗檢測外源性HMGN2入胞及細胞定位(×1000)A.紅色：HMGN2-flag融合蛋白；B.藍色：細胞核；C.疊加效果

3.外源性HMGN2抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲：劃痕試驗結(jié)果顯示HMGN2-flag組中骨肉瘤細胞的遷移顯著低于UT組(圖3中A～C)。Transwell侵襲試驗顯示，HMGN2-flag組中骨肉瘤細胞的侵襲較UT組顯著降低(圖3中D～E)。

圖3 劃痕試驗和Transwell侵襲試驗檢測外源性添加HMGN2對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×100)A.劃痕實驗及顯微鏡監(jiān)測；B.兩組在建立劃痕后24h的遷移率統(tǒng)計分析；C.兩組在建立劃痕后48h的遷移率統(tǒng)計分析；D.Transwell侵襲試驗及染色觀察；E.計數(shù)兩組侵襲細胞并統(tǒng)計分析

4.外源性HMGN2調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達：通過RT-qPCR和Western blot法檢測各組細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9和MMP-16的表達水平。RT-qPCR(圖4中A～C)和Western blot法檢測(圖4D)結(jié)果顯示HMGN2-flag組中MMP-2和MMP-9的表達水平顯著低于UT組，而MMP-16的表達水平兩組比較間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 RT-qPCR和Western blot法檢測兩組MMPs的表達差異A～C.分別為兩組間MMP-2、MMP-9、MMP-16的mRNA表達水平差異；D.兩組間MMP-2、MMP-9、MMP-16的蛋白表達水平差異

討 論

目前尚沒有研究闡述HMGN2抗腫瘤功能的機制。筆者選擇MMPs進行分析，是因為有較多研究顯示MMPs受其他HMGN家族成員調(diào)控，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[16-19]。大約有20%的骨肉瘤患者在初次診斷時即發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移，而25%～50%的患者則隨著病情發(fā)展出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[20]。骨肉瘤的主要治療方法是化療和外科手術(shù)，然而即使在手術(shù)切除和化療后，這些患者中的大多數(shù)最終會發(fā)生轉(zhuǎn)移并死亡。大約90%的骨肉瘤患者在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[21]。因此，亟需要開發(fā)抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的新型治療方案。

在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用的高遷移率族蛋白(HMG)包括HMGA，HMGB和HMGN。HMGNs主要定位于細胞核中且僅在真核生物中表達，含有核小體結(jié)合域(NBD)，HMGN2是HMGN家族的成員。早期研究表明，HMGN2是一種非組蛋白核蛋白，在脊椎動物和無脊椎動物的細胞中廣泛表達，它具有穩(wěn)定核小體形態(tài)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能，其NBD的N末端與組蛋白結(jié)合，而C末端與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[22]。HMGN2缺陷型DT40細胞對紫外線敏感，細胞凋亡率增加，表明HMGN2在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[23]。多項研究表明HMGN2的異常表達與多種腫瘤有關(guān)，并視為一類抗腫瘤因子[7～12]。已有研究證明HMGN2可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞系Tca8113的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。筆者之前的研究表明，以慢病毒感染的方式在骨肉瘤細胞中過表達HMGN2會抑制細胞的轉(zhuǎn)移[14]。然而，目前慢病毒不適用于臨床治療。

IL-2刺激人外周血單核細胞釋放HMGN2。舌鱗狀細胞癌抗原刺激CD8+T淋巴細胞釋放HMGN2[15]。為探討外源性HMGN2是否能進入骨肉瘤細胞，本研究純化了HMGN2-flag融合蛋白，并在骨肉瘤細胞培養(yǎng)基內(nèi)添加該融合蛋白，通過免疫細胞化學(xué)(ICC)檢測蛋白定位。結(jié)果顯示外源性HMGN2能進入骨肉瘤細胞并最終位于細胞核中。為了了解外源性HMGN2是否抑制骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)移，本研究用純化的HMGN2蛋白處理骨肉瘤細胞，并通過劃痕試驗和Transwell侵襲試驗檢測各組骨肉瘤細胞遷移和侵襲的差異。結(jié)果表明，外源性HMGN2進入細胞可抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果可為抗腫瘤藥物的研究提供新的思路。

研究表明HMGN2具有抗腫瘤活性。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制和腫瘤靶向肽研究表明HMGN2可能是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。研究人員從牛肝中提取了21個氨基酸的肽，稱為侵襲抑制劑2(IIF-2)，其被鑒定為與HMGN2的C末端片段一致。體外研究顯示該肽抑制多個腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。而動物研究表明，同時將IIF2和肺癌細胞注射到小鼠尾靜脈可使轉(zhuǎn)移較對照組減少50%～60%。IIF-2與白蛋白結(jié)合可提高其穩(wěn)定性，并使轉(zhuǎn)移形成減少86%。此外，Porkka等還發(fā)現(xiàn)HMGN2還與腫瘤血管生成相關(guān)，從而影響腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，目前還沒有研究解釋HMGN2抗腫瘤功能的機制。

目前已經(jīng)在幾乎所有類型的人類癌癥中檢測到了MMPs的激活，并且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及較差的存活時間密切相關(guān)。有證據(jù)表明HMGN家族成員能調(diào)節(jié)MMPs的表達，并在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16～19]。在開始本項研究前，筆者推測HMGN2可能通過下調(diào)MMPs來發(fā)揮抗腫瘤作用。而本研究結(jié)果表明，外源性HMGN2能下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，并在抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮作用。

本研究證實了外源性HMGN2在骨肉瘤細胞中的抗腫瘤作用。然而，研究結(jié)果還需要大量的體內(nèi)實驗結(jié)果來進一步證實。在下一步研究中將HMGN2和骨肉瘤細胞同時注射到裸鼠的尾靜脈中，以進一步確定外源性HMGN2抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，在之前的研究中證實了過表達HMGN2在人骨肉瘤細胞系中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。而本研究顯示，外源性HMGN2能進入骨肉瘤細胞并調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞中MMP-2和MMP-9的表達，最終有助于抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果為骨肉瘤抗轉(zhuǎn)移藥物的研發(fā)提供了新思路，HMGN2類似物或刺激細胞HMGN2釋放的藥物可作為藥物研發(fā)的備選。