caspase-3和caspase-8在鉛中毒大鼠心肌細胞中的表達特點研究

趙紅宇 李亞山 朱為梅 吳 菲 李德旋 周 盛 楊紅玲

慢性鉛中毒是由于鉛的累計吸收(人體每日鉛吸收量超過0.5mg可發生蓄積作用，當血鉛含量超過50μg/dl可判斷為慢性鉛中毒)而導致的非傳染性疾病[1]。有研究顯示隨著我國工業化發展和日常含鉛產品增多，慢性鉛中毒發生率逐年升高，且呈個別地區集中性[2]。鉛在攝入后主要與血漿蛋白結合，而血漿蛋白可借助于血液流動分布全身，數周后約有95%以磷酸鉛成分沉積于骨骼和毛發。其余5%則分布于軟組織如肝臟、脾臟、腎臟、腦等。近年來鉛中毒受到眾多學者的關注，包括肝、腎以及神經系統均有文獻報道[3,4]。2016年本研究組在云南某地進行鉛中毒流行病學調查發現，鉛中毒地區心力衰竭發生率是正常人群的2.3倍，因此筆者推測鉛中毒可能對心肌有一定損害。目前關于鉛中毒損傷心肌的報道主要見于急性鉛中毒，慢性較少，因此本研究探討慢性鉛中毒對心肌的影響，以進一步明確鉛中毒對心肌的損害作用，為今后臨床中治療慢性鉛中毒提供參考。

材料與方法

1.實驗材料：(1)實驗動物：清潔級雄性SD(Sprague Dawley)大鼠40只，體質量160～180g，購于昆明醫科大學動物實驗部，實驗動物合格證號2011-004。所有大鼠在購買后均飼養于云南中醫藥大學動物實驗樓，飼養間為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，日常溫度22～26℃，濕度40%～60%，光照和黑暗=12h/12h。(2)實驗試劑：醋酸鉛購于吳江市奧邦精細化工有限公司；白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒購于上海嵐派生物科技有限公司；血鉛和心鉛試劑盒購于成都安普諾生物科技有限公司；肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)以及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司；多克隆兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8，caspase-8)抗體和單克隆兔抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于美國Santa Cruz公司；二抗購于上海華壹生物科技有限公司；TRizol RNA、Taq polymerase以及DNA marker提取試劑盒購于寧波有成生物醫藥科技有限公司；RNA 反轉錄酶購于美國Promega公司；PCR引物購于上海生物生工公司。

2.實驗方法：(1) 動物分組：適應性喂養期結束后，所有大鼠均采用尾靜脈取血法收集血液，檢測心功能指標CK、CK-MB和LDH(經檢驗所有指標均在正常范圍內)。后采用數字表法隨機分為正常對照組、低劑量鉛中毒組、中劑量鉛中毒組和高劑量鉛中毒組，每組10只。(2) 造模方法：正常組大鼠給予0g/L醋酸鉛水溶液，低劑量鉛中毒組給予0.5g/L醋酸鉛水溶液，中劑量鉛中毒組給予1g/L醋酸鉛水溶液，高劑量鉛中毒組給予2g/L醋酸鉛水溶液，連續給予1個月(給藥劑量根據文獻[5]報道確定)。(3) 血液和組織收集方法：1個月后隔夜禁食不禁水12h處死大鼠。處死大鼠采用3ml 1%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后固定于解剖板，腹主動脈取血法收集血液，后統一離心并收集上清分裝于1.5ml的離心管中保存備用，血液收集后取出心臟，切取約1/4置于4%多聚甲醛溶液中保存用于病理學檢測，其余保存于超低溫冰箱備用。(4) 生化指標的檢測：血鉛、心鉛、心功能指標CK、CK-MB和LDH、炎性因子指標IL-6、IL-8和TNF-α的測定均根據試劑盒提供的說明書進行。(5) 心肌組織蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色：HE染色操作參考文獻[6]進行，具體為從多聚甲醛溶液中取出心臟組織，自來水沖洗24h后，常規石蠟包埋和染色，切片機切片后二甲苯脫蠟、梯度乙醇和超純水依次清洗、HE染色、二甲苯透明封片即完成。(6)蛋白表達：待檢測蛋白caspase-3以及caspase-8采用蛋白印跡法(Western blot法)，稱取心肌組織1g用組織蛋白裂解液裂解后提取上清，定量調平，然后每組各取50μg行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)凝膠電泳，電泳完成后半干轉移法轉移到聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，洗滌3次后5%脫脂牛奶封閉2h，取出后加入1抗封閉過夜，次日取出加入2抗孵育1h，洗滌3次后暗室曝光洗片，掃描儀掃描后計算各條帶灰度值，每組實驗重復3次。(7) 實時熒光定量PCR：待檢測caspase-3和caspase-8的mRNA檢測方法采用RT-qPCR法，從超低溫冰箱中取出心臟組織，稱取20mg用總RNA提取試劑盒提取總RNA，定量、反轉錄完成后，每組各取2μg行擴增反應。擴增條件為：95℃預變性2min，95℃變性10s、58℃退火30s、72℃延伸35s、循環次數40次，最后72℃延伸5min，完成后采用2-ΔΔCT法統計分析，引物設計見表1。

表1 引物序列設計表

結 果

1.大鼠一般情況：4組大鼠均無死亡，此外各組大鼠在飲食量上也沒有差異，但鉛中毒3個劑量組相較于模型組精神活動量有一定降低。

2.血鉛和心鉛含量比較：與正常組比較，低劑量、中劑量和高劑量鉛中毒組血鉛和心鉛均明顯升高(P<0.05)。與低劑量鉛中毒組比較，中劑量和高劑量鉛中毒組血鉛和心鉛也明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組血鉛和心鉛也明顯高于中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠血鉛和心鉛含量比較

3.心功能指標比較：各組大鼠心功能血清學指標CK、CK-MB和LDH與正常組比較，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組差異無統計學意義，高劑量鉛中毒組則明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組也明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠心功能比較

4.炎性因子指標比較：各組大鼠血清炎性因子指標TNF-α、IL-6和IL-8與正常組比較，低劑量、中劑量和高劑量鉛中毒組明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組TNF-α、IL-6和IL-8明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見表4。

表4 各組大鼠炎性因子比較

5.HE染色：正常組大鼠心肌纖維排列整齊、表面光滑，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組有一定心肌纖維排列紊亂，但和正常組差異并不明顯，而高劑量鉛中毒組則出現明顯心肌肥大、纖維排列無序和細胞界限不清晰，詳見圖1。

6.實時定量RT-PCR結果：與正常組比較，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組心肌組織caspase-3與caspase-8 mRNA表達沒有差異，而高劑量鉛中毒組則明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組也明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見圖2。

7.蛋白表達結果：與正常組比較，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組心肌組織中caspase-3與caspase-8蛋白差異無統計學意義，而高劑量鉛中毒組則明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組也明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見圖3。

圖1 大鼠心肌組織HE染色(×400)A.正常組;B.低劑量鉛中毒組；C.中劑量鉛中毒組;D.高劑量鉛中毒組

圖2 各組大鼠心肌組織中caspase-3和caspase-8的mRNA擴增特點A.正常組;B.低劑量鉛中毒組;C.中劑量鉛中毒組;D.高劑量鉛中毒組；正常組比較，*P<0.05；與低劑量鉛中毒組比較，#P<0.05；與中劑量鉛中毒組比較，ΔP<0.05

圖3 各組大鼠心肌組織中caspase-3和caspase-8的相對表達A.正常組;B.低劑量鉛中毒組;C.中劑量鉛中毒組;D.高劑量鉛中毒組；與正常組比較，*P<0.05；與低劑量鉛中毒組比較，#P<0.05；與中劑量鉛中毒組比較，ΔP<0.05

討 論

鉛中毒引起心肌損傷已得到大量臨床和基礎實驗證實[7～10]。Chyeny等[11]研究發現，鉛中毒人群相較于正常人群暫時性以及永久性心功能損害率均明顯升高。劉穎等[12]以昆明市東川區某中型銅冶煉生產企業448例鉛作業工人為考察對象，比較了心功能多項指標的變化特點，結果發現鉛工作人員有明顯心電圖異常，心肌酶譜關鍵酶類CK-MB明顯升高，且升高趨勢與血鉛濃度明顯相關，工作人員接受驅鉛治療后，CK-MB則明顯下降。此外還有很多類似的研究[13～15]。毫無疑問，上述研究均證實，鉛中毒對心肌確有一定損害作用，這與本研究結論也是一致的。本研究采用不同劑量的醋酸鉛構建慢性鉛中毒大鼠模型，結果發現，與正常組比較，大鼠日常自由飲用2g/L醋酸鉛水溶液1個月，可有明顯心肌代謝酶異常，主要表現為CK、CK-MB和LDH的升高。同時在研究中檢測了炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量，研究結果發現，與正常組比較，低劑量、中劑量和高劑量鉛中毒組TNF-α、IL-6和IL-8均明顯升高，其與心功能的改變并不一致，分析原因可能是鉛中毒早期就可能存在炎性反應的發生，只有達到一定閾值，才會引起心肌酶代謝譜的異常。

關于鉛中毒引起心肌損害的主要原因：①腦皮質-心臟系統，部分研究者認為鉛中毒對心功能的損害是通過腦皮質-心臟系統作用的，鉛中毒后腦是首要損害器官之一，當腦中有大量鉛沉積時，可引起大腦皮質興奮與抑制功能紊亂，進而使神經轉導異常，最終導致皮質-心臟調節障礙；②直接損害心肌，鉛可直接作用心肌細胞，通過抑制心肌收縮和傳導，進而誘發心肌細胞對外界刺激興奮性異常，同時造成心臟自主神經紊亂，最終導致冠狀動脈灌注不足；③損害陽離子轉運酶系統，血鉛可影響心肌微粒體中的陽離子轉運酶，而陽離子轉運酶與鈣離子轉運密切相關，鈣離子轉運異常最直接后果為心肌細胞功能紊亂[16～18]。但是總結上述成果，相關研究并沒有涉及對心肌本身損害的研究。

細胞凋亡是細胞自主死亡現象，也是所有細胞的最終結局[19]。一般而言，細胞凋亡是正常的，但在病理情況下，如受到外界有害因子的刺激，其凋亡會加速發生[20]。由于心肌細胞具有不可再生性，因此當凋亡發生后，可能會帶來心肌部分功能的永久喪失[21]。在凋亡調控相關蛋白中，caspase家族是核心之一，研究發現,caspase家族蛋白參與心肌細胞凋亡主要為caspase-8和caspase-3蛋白，其中caspase-8位于凋亡級聯通路的上游，本身并不會促進凋亡，但可刺激下游caspase-3、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2相關x蛋白(Bcl-2 associated x protein, Bax)發揮作用，最終引起凋亡發生[22～24]。本研究結果顯示，與正常組比較，低劑量和中劑量鉛中毒組心肌組織中caspase-8和caspase-3并沒有明顯升高，而高劑量組則明顯升高，分析原因，可能是大鼠對鉛有一定的代謝能力，當在可控濃度范圍內是不會對心肌造成損害的，而當其超出心肌可承受范圍，則會造成心肌細胞凋亡。

綜上所述，給予大鼠2g/L醋酸鉛水溶液自由飲用1個月，可引起其心肌酶譜的異常，其機制可能是鉛攝入引起心肌caspase-8和caspase-3表達升高作用的。但本研究也有一定的局限性，這主要是因為慢性鉛中毒是一個緩慢的過程，在其進展中可能涉及多種信號通路調控，具體為哪條信號通路調節作用的仍需進一步明確。