松果菊苷通過調控SIRT1/PGC-1α信號通路改善肥胖糖尿病小鼠肝損傷

楊 洛 唐鳳娟 張 祥 廖 敏 郝亞榮

2型糖尿病(T2DM)作為嚴重威脅人類身心健康的慢性代謝性疾病，會造成全身多器官損傷，其肝臟損傷以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)最常見。肝細胞中過多的脂質積累，不僅會干擾代謝過程，還可能導致炎癥、肝纖維化，甚至肝癌[1]。由于這種疾病的發病機制在很大程度上仍然未知，因此盡管肝臟并發癥在T2DM患者中具有較高的發生率和重要的臨床意義，但在臨床實踐中通常會被忽視。目前普遍使用治療糖尿病的臨床藥物包括二甲雙胍、磺脲類、TZDs、DPP-4抑制劑等，多會導致肝功能受損等不良反應從而禁用于肝功能不全的患者。因此，新藥的開發與研究具有非常重要的意義。松果菊苷是肉蓯蓉的主要成分，并且具有許多藥理性質，例如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝和免疫調節活性[2]。沉默信息調節因子2相關酶1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)是脂類和葡萄糖代謝的關鍵調節因子之一，它可以提高肝臟和其他組織的胰島素敏感度，并減輕肝臟脂肪變性[3]。db/db小鼠是一種自發性肥胖2型糖尿病小鼠，隨著周齡增加可出現貪食、肥胖，明顯的高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特征，其發病過程與2型糖尿病患者相似[4]。本研究擬采用db/db小鼠作為2型糖尿病肝損傷模型，予以松果菊苷(ECH)灌胃，觀察松果菊苷對糖尿病肝損傷的影響及其作用機制。

材料與方法

1.實驗動物：自發性2型糖尿病db/db小鼠(6周齡，20只)；同窩db/m小鼠(6周齡，9只)，均為雄性，購自南京大學-南京生物醫藥研究所，動物生產合格證編號：SCKK(蘇)2015-0001，飼養在武漢大學人民醫院中心實驗室動物房(SPF級)，每籠4～5只，室溫22±2℃，相對濕度60%，每日12h光照/12h黑暗交替，期間自由攝食、飲水，常規普通飼料喂養。本實驗均符合武漢大學人民醫院實驗動物倫理學相關規定的要求。

2.主要儀器與試劑： One Touch Ulta血糖儀及血糖試紙(美國強生公司)；電子天平(Metter Toledo公司)；AU640全自動生化儀(日本Olympus公司)；BX63型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；多功能酶標儀DR-200Bs(美國Diatek公司)；實時熒光定量PCR檢測儀(美國ABI公司)。松果菊苷(美國Sigma公司，純度94%)；4%多聚甲醛(谷歌生物科技有限公司)；蘇木精染液(國藥集團化學試劑有限公司)；伊紅生物染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；油紅O染液(上海晶都生物技術有限公司)；兔抗人單克隆抗體SIRT1(貨號#9475)購自美國CST公司，PGC-1α(貨號ab54481)、PPARα(貨號ab8934)、GAPDH(貨號ab37168)購自英國Abcam公司，CPT1(貨號15184-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)；預染蛋白Marker(美國Thermo公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(谷歌生物科技有限公司)；RT-PCR反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

3.動物分組與給藥：實驗開始前，6周齡小鼠經過檢疫1周及適應性飼養1周。編號并采用數字表法將db/db小鼠隨機分為兩組：1～10號為糖尿病模型組(db/db組，n=10),11～20號為松果菊苷治療組(db/db+ECH組，n=10)，db/m小鼠9只作為正常對照組(db/m組，n=9)，8周齡時分別給予如下干預：正常對照組和糖尿病模型組每天按照0.05ml/10g體質量進行0.9%氯化鈉注射液灌胃,松果菊苷治療組按松果菊苷300mg/(kg·d)灌胃。期間自由飲食飲水，持續10周。

4.一般情況與空腹血糖：實驗期間觀察小鼠的狀態、攝食、飲水和毛色光澤度等一般情況。各組從實驗第1周(小鼠8周齡)開始，每周檢測體質量，尾靜脈取血測空腹血糖。

5.標本采集：干預10周后，禁食不禁水處理12h，麻醉后眼眶采血，迅速分離血清，保存于-80℃冰箱用于生化指標檢測。取血后處死小鼠，用生理鹽水心臟灌流，解剖取肝臟并稱取質量。肝質量指數(liver index，LI)=[肝質量(g)/體質量(g)]×100%。留取部分新鮮肝組織行病理切片，剩余肝臟組織置于液氮1h后保存在-80℃冰箱用于后續蛋白檢測和實時免疫熒光定量PCR。

6.肝臟病理組織學檢查：迅速分離新鮮肝組織，一部分用4%多聚甲醛固定24h后脫水石蠟包埋切片，二甲苯將切片脫蠟至水，蘇木精染細胞核，伊紅染細胞質，脫水后中性樹膠封片；另一部分組織OTC包埋后切片，50%乙醇稍洗后用油紅O工作液染色，50%乙醇分化,蒸餾水浸洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，流水返藍，風干后封片。光學顯微鏡下觀察肝組織病理組織學改變。

7.血清、肝組織生化指標檢測：血清標本送至武漢大學人民醫院檢驗科使用全自動生化檢測儀檢測，血脂指標：甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)；肝功能指標：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

8. Western blot法檢測肝組織中SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白質表達：取凍存的肝組織剪碎，取50mg，加入1ml RIPA 裂解液提取總蛋白，4℃13000r/min離心5min，收集上清液即為總蛋白溶液，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。各組取40μg蛋白量上樣，轉膜至 PVDF 膜上，抗體孵育后行化學發光檢測，將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶的吸光度值,GAPDH作為內參照進行半定量分析。

9.RT-PCR檢測肝組織中SIRT1、PGC-1α mRNA表達：從-80℃冰箱取各組小鼠肝組織約100mg，按Trizol試劑盒提取總RNA，紫外吸收法進行RNA質量檢測后反轉錄成cDNA。按照SYBR Green法配置反應體系擴增cDNA，每組樣本至少3個復孔，操作在冰上進行。使用Primer Premier 5.0軟件設計SIRT1、PGC-1α引物序列，由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，以管家基因β-actin為內參照, β-actin上游引物序列為5 ′- CTATCCTTCTTCGCAT-3′，下游引物序列為 5′-TAATTGTCGCAGATCG-3′；SIRT1上游引物序列為5′-TCGTGGAGACATTTTTAATCAGG-3′，下游引物序列為5′-GCTTCATGATGGCAAGTGG-3′；PGC-1α上游引物序列為5′-CCCTGCCATTGTTAAGACC-3′，下游引物序列為5′-TGCTGCTGTTCCTGTTTTC-3′。擴增條件：95℃預變性30s；95℃變性5s，65℃退火30s，共40個循環。反應結束后通過溶解曲線分析來確定PCR擴增特異性，讀取 Ct 值并采用2- △△Ct法計算目的基因 mRNA 相對表達量。

結 果

1.一般情況：實驗過程中正常對照組小鼠狀態良好，毛色光滑，精神活躍；糖尿病模型組出現多飲多食現象，明顯肥胖，蜷伏不喜動，毛發粗糙暗沉;松果菊苷治療組與糖尿病模型組比較，在各方面均有一定程度的好轉。

2.松果菊苷對糖尿病小鼠肝質量指數和空腹血糖的影響：在實驗進行第10周時，與正常對照組比較，糖尿病模型組肝質量指數和空腹血糖都顯著增加(P<0.01)，而松果菊苷治療組小鼠肝質量指數較糖尿病模型組下降，差異有統計學意義(P<0.05)，血糖降低，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 各組小鼠肝質量指數及空腹血糖的比較

3.松果菊苷對糖尿病小鼠肝臟形態學改變的影響：HE染色可見正常對照組肝細胞大小形態正常，肝小葉和肝竇結構清晰；糖尿病模型組可見廣泛肝細胞變性氣球樣改變，肝細胞體積增大，胞核大小不均，病灶細胞壞死與匯管區炎性細胞浸潤；松果菊苷治療組明顯脂滴和炎性細胞減少，細胞壞死損傷減輕；油紅O染色鏡下觀察正常對照組肝臟組織細胞排列整齊，未見脂滴和病理改變；糖尿病模型組細胞排列紊亂，胞質中出現大量大小不一的脂肪顆粒。與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組脂滴染色明顯減少。

圖1 各組小鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色(×200)

4.松果菊苷對糖尿病小鼠肝功能和脂質代謝的影響：肝功能與正常對照組比較，糖尿病模型組小鼠ALT明顯升高(P<0.01)，同樣AST也升高(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組ALT降低(P<0.05)，AST也明顯降低(P<0.01)；血脂水平與正常對照組比較，糖尿病模型組TC、TG、LDL-C顯著升高(P<0.01)，HDL-C顯著降低(P<0.05)；與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組TC、TG、LDL-C降低, HDL-C升高(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 各組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C含量與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與糖尿病模型組比較，#P<0.05

5.松果菊苷對糖尿病小鼠肝臟SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白質表達的影響：Western blot法檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型組小鼠肝臟組織SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1α蛋白質水平明顯降低(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，松果菊苷治療組蛋白質水平明顯升高(P<0.01)，詳見圖3。

圖3 各組SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白表達量和相對灰度比與正常對照組比較，*P<0.01；與糖尿病模型組比較， #P<0.01

6.松果菊苷對糖尿病小鼠肝臟SIRT1、PGC-1α mRNA 表達的影響：RT-PCR檢測結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病模型組SIRT1、PGC-1α明顯降低差異有統計學意義(P<0.01)；與糖尿病模型組比較，經松果菊苷干預后，SIRT1明顯增加(P<0.01)以及PGC-1α明顯增加(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 各組SIRT1、PGC-1α mRNA相對表達量與正常對照組比較，*P<0.01；與糖尿病模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

糖尿病是全球主要的醫學問題之一，到2035年全球糖尿病發生預計將達到5.92億。我國糖尿病發生率呈明顯增加趨勢，其中大部分為2型糖尿病。2型糖尿病與肝病變有著復雜的牽連,其引起的肝損傷以非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)最為常見。NAFLD現已被公認為全球最常見的慢性肝病，是一種以肝臟脂肪沉積過多為特征的病理狀態[5]。NAFLD與胰島素抵抗和血脂異常密切相關，在2型糖尿病和(或)肥胖者中高度流行。許多代謝因素已被證明與NAFLD的發展有關，盡管如此，這種疾病的發病機制仍然很大程度上未知[1]。管花肉蓯蓉是一種多年生寄生植物，生長于固沙植物的根部，根據《中國藥典》，肉蓯蓉通常被用作治療腎臟疾病和不孕不育[6]。

近年來有研究證實管花肉蓯蓉能夠顯著抑制db/db小鼠空腹和餐后血糖水平升高，改善胰島素抵抗和血脂異常，減輕體質量[7]。本實驗結果顯示，肥胖和糖尿病會引起小鼠肝損傷，表現為血清ALT、AST水平顯著升高和典型組織病理學改變。松果菊苷可顯著降低小鼠的肝質量指數和血糖，同時降低TC、TG、LDL-C的水平并且提高HDL-C水平，組織病理檢查上顯示松果菊苷能夠減輕肝細胞脂肪樣變性和炎性細胞浸潤，證實松果菊苷能夠改善肥胖糖尿病小鼠肝損傷。

沉默信息調節因子2相關酶1 (silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1)，是一種NAD依賴性脫乙酰酶，最近已被證明與NAFLD的病理生理有關[8]。SIRT1參與各種細胞生理過程，例如脂質和葡萄糖的穩態以及胰島素敏感度，是代謝的關鍵調節因子。該酶在肝臟中高度表達，抑制SIRT1會上調糖異生和脂肪生成相關基因的表達，從而導致細胞內葡萄糖和脂質水平的升高[9]。肥胖患者，尤其是胰島素抵抗、糖尿病和NAFLD患者的SIRT1水平較低[10]。Price等[11]已經介紹了SIRT1在預防肝臟脂肪變性中的作用，并且發現NAFLD患者中的SIRT1表達水平降低。有研究表明，肝細胞特異性敲除SIRT1可減少脂肪酸氧化，誘導了肝臟中脂肪變性和炎癥；而過表達SIRT1可通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)轉導通路改善脂質代謝[12]。PGC-1α活性受SIRT1調節，并且二者都是維持細胞能量穩態的關鍵[13]。因此，SIRT1/PGC-1α可能是肝損傷的關鍵靶點。PGC共激活因子是一種可以與轉錄因子或核受體相結合增加轉錄活性的蛋白質，大多數轉錄因子均需要輔助激活因子，特別是核受體PPAR，過氧化物增殖物激活受體α(PPARα)主要存在于肝臟、心肌和骨骼肌等氧化組織中，它可激活促進脂肪酸轉運和氧化、酮生成和糖異生的基因轉錄[14]。肉堿脂酰轉移酶1 (CPT1)是脂肪酸氧化的關鍵限速酶，其表達受復雜的轉錄機制調控，涉及多種轉錄因子(TF)和輔助激活因子，包括SIRT1、PGC-1α、PPARα等。

本研究在糖尿病模型組高血糖濃度下，伴隨著SIRT1的表達下調，肝細胞中脂質積累增加；在松果菊苷治療組中SIRT1、PGC-1α蛋白質和mRNA表達顯著增加，下游因子PPARα、CPT1蛋白質表達顯著增加，這表明SIRT1 / PGC-1α信號軸及其下游因子參與了糖尿病肝損傷后治療的有益作用。綜上所述，松果菊苷通過調控SIRT1/PGC-1α及其下游因子的表達能夠調節血糖和脂質代謝，從而改善糖尿病肝損傷。