Transgelin基因在主動脈壁中異常表達對主動脈夾層的影響

郭 嫻 蔣丁勝 魏 翔 陳 軍

主動脈夾層(aortic dissection，AD)是致死率極高的心血管危重疾病，系主動脈內膜破裂，血液進入主動脈管壁內使中膜發生分離，并沿主動脈長軸方向延伸形成真、假腔分離結構。主動脈夾層號稱“人體的定時炸彈”，一旦主動脈壁外膜破裂，血液瞬間涌出，患者幾乎無挽救可能。據世界衛生組織不完全統計，主動脈夾層發生率約6例/(10萬人·年)，因主動脈夾層或主動脈瘤病死率由1999年的2.49例/10萬人上升至2010年的2.78例/10萬人[1]。主動脈壁由外膜、中膜、內膜3部分構成。主動脈中層囊性退變(包含彈性蛋白斷裂和平滑肌細胞減少)、纖維化、動脈粥樣硬化斑塊形成以及炎性浸潤是主動脈夾層的病理基礎[2]。其中，平滑肌細胞減少和胞外基質(extracellular matrix, ECM)降解導致中膜退化是主動脈夾層最經典的特征之一，提示平滑肌細胞穩態和ECM的動態平衡是影響主動脈夾層發生的重要因素[3]。

平滑肌細胞(smooth muscle cell, SMC)是主動脈中層的主要組分，約占整個主動脈壁結構的35%，它在維持血管壁穩態中發揮重要作用[4]。SMC表型轉化，是影響血管壁穩態的重要因素之一，在血管損傷修復過程中發揮重要作用[5]。SMC有分化型(收縮型)和去分化型(合成型)，兩種表型之間可相互轉化。生理狀態下，大部分SMC為收縮表型，維持血管彈性和機械應力；而在病理狀態下，SMC細胞由收縮型向合成型轉化，血管壁收縮功能異常、彈性變差、抗擴張能力下降。有文獻報道，大多數類型細胞的增殖、遷移、凋亡進程受到改變細胞骨架肌動蛋白結構或張力產生相關因子的調控[6]。

Transgelin編碼SM22(smooth muscle 22)蛋白，是平滑肌細胞骨架肌動蛋白結合蛋白，屬于鈣調節蛋白家族，它是SMC收縮表型的標志分子。Transgelin在體內和體外均能與細胞骨架肌動蛋白結合，通過調節收縮纖絲蛋白使SMC展現出分化/收縮表型[2]。盡管Transgelin基因對SMC細胞功能的調控已有部分文獻報道，但Transgelin在主動脈夾層中的作用尚不明確。鑒于SMC對主動脈夾層的發生、發展至關重要，而Transgelin對SMC的功能具有重要的調節作用，提示 Transgelin可能通過調控血管平滑肌細胞(vessel smooth muscle cell, VSMC)的表型轉化，從而影響主動脈夾層的發生、發展。本研究檢測了Transgelin在TAAD患者主動脈壁中的表達，分析其表達水平與夾層主動脈血管壁直徑的相關性，確定Transgelin在主動脈夾層血管壁中的表達模式，探討Transgelin作為輔助診斷主動脈夾層的臨床應用價值。

材料與方法

1.主動脈壁來源：13例夾層主動脈壁均取自經CT血管成像造影(CTA)明確診斷為A型主動脈夾層(TAAD)患者；11例無夾層主動脈壁來自擴心病或冠心病患者心臟移植受體，合并馬方綜合征、創傷性或醫源性主動脈夾層、腫瘤、免疫系統疾病等均不納入本研究，以上手術均在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院完成。本實驗涉及到臨床標本采集以及病患病史資料調研均獲得患者或家屬的知情同意，并經華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院醫學倫理學委員會審批同意。

2.主動脈直徑測量：在TAAD患者CTA中分別測量氣管分叉處升主動脈、主動脈弓、降主動脈的峰值以及腹腔干處主動脈直徑最大值[7]。

3.組織病理分析：主動脈壁經手術切除后經冷0.9%氯化鈉注射液沖洗后，迅速置于4%中性甲醛溶液中進行固定。充分固定后的組織，經脫水、石蠟包埋、切片后，按照標準流程進行蘇木精-伊紅(HE)染色、EVG染色和免疫組化(IHC)染色[8, 9]。染色結果通過奧林巴斯光學顯微鏡BX53成像系統拍攝圖片。

4.總RNA提取以及反轉錄-熒光定量PCR分析：稱取約50mg主動脈壁組織，用Trizol法提取總RNA, 根據反轉錄試劑盒說明書采用兩步法將mRNA反轉錄成cDNA，再用SYBR?Green Supermix擴增檢測Transgelin基因表達變化。以18S作為內參，引物序列如下：18S正向引物：5′-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3′,反向引物：5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′;Transgelin正向引物：5′-GCAGTCCAAAATCGAGAAGAAG-3′,反向引物：5′-CAGAATCACGCCATTCTTCAG-3′。

5.蛋白質免疫印跡(Western blot)法: 稱取約50mg主動脈壁組織用液氮研磨成粉末狀，加入300μl含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA強裂解液，用勻漿儀低溫勻漿。后續步驟參照文獻[8]。根據總蛋白免染膠結果歸一化分析，計算統計學差異。

結 果

1.臨床資料：入選患者的臨床資料見表1，主動脈夾層患者和對照組之間的臨床基本資料差異無統計學意義，兩組間具有可比性。主動脈夾層患者均經CTA明確診斷為Stanford A型主動脈夾層，CTA結果可見夾層累及部位包括升主動脈、主動脈弓部、降主動脈(圖1)。

表1 主動脈夾層患者與對照組臨床資料對比

圖1 主動脈夾層患者CT血管成像造影以及三維重建圖像A.主動脈弓部；B.升主動脈和降主動脈；C.側位圖；D.三維重建側位圖

2.組織病理染色結果：HE染色結果顯示對照組主動脈壁中層彈性纖維、膠原纖維以及平滑肌細胞排布緊密有序，而主動脈夾層組結構分布較為亂序，并有明顯的紅細胞浸潤。EVG染色結果表明，對照組主動脈壁中彈性纖維形態完整、連續，而主動脈夾層組主動脈壁彈力纖維斷裂明顯并伴有量的減少(圖2)。

3.Transgelin基因在主動脈壁組織中的分子水平檢測：通過實時熒光定量PCR檢測Transgelin在主動脈壁中的mRNA表達水平，結果顯示，與對照組比較，Transgelin的mRNA水平在主動脈夾層患者中有升高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05,圖3)。進一步通過Western blot法檢測Transgelin的蛋白表達水平，結果顯示，主動脈夾層患者主動脈壁中的Transgelin蛋白水平明顯較對照組高，且差異有統計學意義(P<0.05,圖4)。免疫組化進一步研究Transgelin在主動脈壁細胞中的表達及亞細胞定位情況，對照組主動脈壁中僅有少量Transgelin的表達，而Transgelin在主動脈夾層患者主動脈壁中表達量顯著升高，且Transgelin主要定位于細胞質中(圖5)。

圖2 對照和主動脈夾層主動脈壁HE染色及EVG染色結果

圖3 Transgelin基因在主動脈壁中mRNA變化

圖4 Transgelin編碼的SM22蛋白在主動脈壁中蛋白變化(A)以及相對定量結果(B)

4.Transgelin基因表達與主動脈夾層發生的相關性分析：筆者將Transgelin的mRNA表達量與主動脈夾層患者的主動脈直徑進行Pearson相關性分析，結果顯示， Transgelin的表達與主動脈夾層患者的升主動脈和主動脈弓部直徑擴張無顯著相關性(圖6)。

圖5 Transgelin編碼的SM22蛋白在主動脈壁中的表達和亞細胞定位情況(A)以及免疫組化陽性率定量結果(B)

圖6 主動脈夾層患者主動脈直徑與Transgelin mRNA表達量的相關性分析A.升主動脈；B.主動脈弓部

討 論

平滑肌細胞是主動脈中膜重要的組成部分，其功能(表型轉化、遷移、炎癥、自噬、增殖、死亡等)紊亂與主動脈夾層發生密切相關[9～13]。已有文獻報道Transgelin基因編碼的SM22蛋白在平滑肌細胞穩態中發揮重要作用。如SM22能抑制血管平滑肌細胞(VSMC)增殖,促進收縮型VSMC遷移，抑制合成型VSMC細胞遷移，顯示出兩種不同細胞表型的調控模式[5,14]。本研究中筆者發現Transgelin在主動脈夾層患者主動脈壁中表達顯著升高，提示可能在主動脈夾層發生過程中由于平滑肌細胞的減少，存活的平滑肌細胞為了代償其功能，會進一步增加收縮蛋白Transgelin的表達，以期維持主動脈壁的正常功能。

此外，有研究報道在VSMC中過表達SM22能抑制促炎性細胞因子淋巴毒素，刺激介導的NF-κB炎癥信號通路激活[15]。在動脈損傷模型中SM22基因敲除小鼠體內線粒體和NAPDH氧化酶活性增強導致活性氧增多, 炎癥基因表達上調[16]。以上研究提示SM22不僅與VSMC的增殖、遷移相關，還參與VSMC以及主動脈壁中的炎性反應。眾所周知，炎性反應對主動脈夾層的發生、發展至關重要，其不僅參與主動脈夾層的起始，且與主動脈夾層的進一步發展乃至夾層破裂均密不可分[17]。盡管SM22可參與VSMC中炎性反應的調節，但其并不是主要的炎癥調控分子。因此，雖然Transgelin在夾層患者主動脈壁中代償性的升高，但其可能并不足以逆轉主動脈夾層患者的炎性反應。

本研究結果發現，主動脈夾層患者中Transgelin的mRNA水平雖有升高，但差異無統計學意義，而其蛋白水平則顯著上調，說明Transgelin蛋白水平的升高不僅與轉錄激活有關，可能還與其蛋白質穩定性相關。此外，由于本研究納入的樣本偏少，而由于遺傳背景、用藥品種以及時間不同，導致臨床樣本之間的差異又較大，最終導致其mRNA和蛋白水平統計學上的差異。將Transgelin的mRNA表達量與夾層患者的主動脈直徑進行相關性分析發現Transgelin的表達與主動脈直徑并無明顯的相關性，提示Transgelin可能并不參與主動脈病變的進展，而只是與主動脈夾層的發生相關。然而，Transgelin對主動脈夾層的發生、發展有何影響，何種機制參與其中？以上問題還需通過更深入的動物實驗進行探討。本研究結果為將來的研究提供了一定的基礎，且提示Transgelin有望成為輔助診斷主動脈夾層的生物學標志物。