線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對冠心病大鼠心肌細胞影響及機制研究

謝玉霞 姜海兵 楊 潔 張 靜 梁 鋮 劉文寧

冠心病作為嚴重危害人類健康的疾病之一，近年來的發病逐漸趨于年輕化，且病死率一直居高不下[1，2]。冠心病的發病以動脈粥樣硬化為基礎，動脈粥樣硬化引發心肌細胞的損傷，推進冠心病的病理進程，緩解心肌細胞的損傷亦是臨床上控制冠心病的重要環節之一[3,4]。因此，發現更多能夠有效控制心肌細胞損傷的藥物至關重要。ATP敏感性鉀離子通道是位于心臟和血管平滑肌上且能夠被細胞內ATP和其他腺嘌呤核苷酸抑制的內向整流 K+通道，其中線粒體 ATP 敏感性鉀離子通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP)廣泛的存在于線粒體內膜上，當細胞內 ATP 消耗降低時，該通道開放，促進線粒體氧化磷酸化產生ATP[5,6]。二氮嗪作為mitoK-ATP開放劑已經被證明具有對抗心肌損傷的作用，但其對心肌細胞的作用機制研究尚不完善。本研究旨在探討二氮嗪對冠心病大鼠心肌細胞影響及機制，為臨床研究提供幫助[7,8]。

材料與方法

1.材料: 健康清潔級SD大鼠，50只，體質量150±20g[新疆醫科大學動物實驗中心,實驗動物許可證號：SCXK(新)2018-0011]；高脂飼料(南京卡文斯生物技術有限公司)；垂體后葉素(安徽宏業藥業有限公司)；苯妥英鈉(南京谷歌生物技術有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6檢測試劑盒(福麥斯生物技術有限公司)； 原位缺口末端轉移酶標記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)凋亡檢測試劑盒(北京素萊寶科技有限公司)；Kir6.2、ERK1/2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體，山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；電泳儀(南京大學儀器廠)；微型垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

2.冠心病大鼠造模: 50只大鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、二氮嗪低、中、高劑量組；除對照組外，其余各組大鼠高脂飲食6周后腹腔注射垂體后葉素(30μg/kg)，1次/24h，共3次，構建冠心病大鼠模型；造模后給藥治療14天，二氮嗪低、中、高劑量組給藥劑量分別為3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg，每天灌胃給藥1次，對照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液。

3.Elisa檢測血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平: 實驗結束后，腹腔注射 50mg/kg 苯妥英鈉麻醉大鼠，腹主動脈取5ml全血，室溫靜置4h后，3500r/min，4℃離心15min，分離上層血清，按照Elisa試劑盒檢測方法，主要步驟為鋪好一抗的96孔板內加入40μl待測樣品和10μl生物素標記抗體后，加入100μl辣根過氧化物酶標記抗體，37℃孵育75min，清洗96孔板后加入顯色劑顯色，終止后于酶標儀450nm處測吸光度，根據標準曲線計算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

4.HE染色檢測心肌組織病理變化: 給藥結束后，腹腔注射50mg/kg苯妥英鈉麻醉大鼠，摘除大鼠心臟并將其置于冰上，用醫用紗布包裹輕輕按壓排凈心臟內血液，并在距心尖2mm 處沿橫向將其切開，取寬約 2mm 的心臟組織放于組織固定液中固定72h，其余部分于-80℃保存。固定后將組織用梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋后制成組織切片，然后將石蠟切片進行透明水化，HE染色、封片后于顯微鏡下拍照，觀察組織病理變化。

5.TUNEL檢測大鼠心肌細胞凋亡: 將制備好的石蠟切片經常規二甲苯及各梯度乙醇脫蠟至水，蒸餾水水化5min，用0.1mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中進行熱修復，分別經過3%H2O2甲醇液、0.1%TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反應混合液、過氧化物酶(peroxidase, POD) 轉化劑孵育及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)沖洗后，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB) 溶液顯色，并在顯微鏡下觀察，終止后用邁耶蘇木精染核，PBS 沖洗后，甘油封片劑封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。

6.Western blot法檢測心肌組織Kir6.2和caspase-3的表達水平: 取各組大鼠心臟組織約 60mg于10ml EP管中，加入500μl RIPA 蛋白裂解液及5μl的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，于組織勻漿機中勻漿均勻，然后將各組樣品 4℃低溫下裂解 30min后置于 4℃離心機中12000r/min離心10min并取上清液，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量法檢測總蛋白的含量。進行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate, SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，用5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)對PVDF膜封閉2h，然后以稀釋后的GAPDH、 Kir6.2和ERK1/2一抗4℃孵育過夜，洗膜后室溫孵育二抗1.5h，洗膜后將聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜浸入發光液，曝光并拍照，用Image J軟件曝光結果進行定量分析。

結 果

1. 血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6檢測結果: 與對照組比較，模型組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，二氮嗪低、中、高給藥組其血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低(P<0.05)，呈劑量依賴性(表1)。

2.HE染色結果: 對照組大鼠心肌組織結構完整，心肌細胞排列整齊，細胞形態正常，未表現出明顯的病理損傷；模型組大鼠心肌結構損傷嚴重，心肌細胞大面積壞死，心肌細胞水腫嚴重，有大量炎性細胞浸潤，表明造模成功；二氮嗪低劑量組，心肌細胞損傷較模型組有所緩解，炎性細胞浸潤有所減少，但仍存在顯著的病理損傷；二氮嗪中、高劑量組心肌組織損傷顯著緩解，病變部位局限，心肌細胞排列整齊，心肌水腫減弱，且呈劑量依賴性(圖1)。

表1 各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6檢測結果比較

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結果(×20)A.對照組；B.模型組；C.二氮嗪低劑量組；D.二氮嗪中劑量組；E.二氮嗪高劑量組

3.原位缺口末端轉移酶標記法(TUNEL)檢測大鼠心肌細胞凋亡結果: 與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡數目顯著增多(P<0.05)，提示冠心病大鼠心肌細胞凋亡嚴重，從而造成心肌組織損傷；與模型組比較，二氮嗪低、中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡數目顯著減少(P<0.05)，且呈現劑量依賴性(圖2)。

4.Western blot法檢測Kir6.2和ERK1/2的表達：與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Kir6.2表達量增加(P<0.05)，提示可能是由于冠心病心肌細胞損傷引起Kir6.2表達代償性增高，其余各組Kir6.2表達量均顯著升高(P<0.05)，提示線粒體ATP敏感性鉀離子通道處于大量開放狀態；與模型組比較，二氮嗪低、中、高劑量組大鼠心肌組織Kir6.2表達量均顯著提高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。與對照組比較，模型組大鼠心肌組織ERK1/2表達量顯著增高(P<0.05)，與模型組比較，二氮嗪低、中、高劑量組ERK1/2表達量顯著減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性(圖3)。

圖3 各組大鼠心肌組織Kir6.2和ERK1/2表達水平A.Western blot法檢測結果；1.對照組；2.模型組；3.二氮嗪低劑量組；4.二氮嗪中劑量組；5.二氮嗪高劑量組;B.各組大鼠心肌組織蛋白相對表達量；與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

討 論

冠心病作為心血管疾病之一，一直是國內外心血管方向研究的重點，心血管疾病大多發病機制復雜，治療困難，且患者預后較差。目前臨床治療冠心病的主要是通過手術和藥物治療，在藥物治療中，保護心肌細胞，阻止其進一步損傷是重要的環節[9]。有研究表明，心肌細胞特有的ATP敏感性鉀離子通道的開放對心肌細胞有顯著的保護作用，主要表現在線粒體內膜上的ATP敏感性鉀離子通道開放可以促進線粒體氧化磷酸化產能，二氮嗪作為高選擇性線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑，低劑量即可有效誘導其開放[10～12]。本研究通過構建冠心病大鼠模型，探究了二氮嗪對冠心病大鼠心肌組織細胞的影響及機制。

炎性反應貫穿冠心病發生發展的全過程，已有研究表明，冠心病患者血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的升高導致動脈斑形成加速、血栓形成加速、血管通透性增加等病理現象，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子亦可作為動脈粥樣硬化的治療靶點[13]。本研究結果顯示，二氮嗪能夠顯著降低冠心病大鼠血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，提示二氮嗪具有能夠顯著抑制炎性反應的作用。

細胞凋亡是指細胞內部一系列基因調控的改變而引起的細胞程序性死亡，已有研究表明，動脈粥樣硬化、冠心病、心律失常等心血管疾病均與心肌細胞的凋亡有關[14～16]；在細胞早期凋亡的過程中會消耗大量的ATP，引起細胞能量代謝不足而大面積凋亡，二氮嗪作為線粒體ATP依賴性鉀離子通道開放劑能夠增加線粒體產能為細胞提供能量，緩解細胞的凋亡[17]。本研究結果顯示，二氮嗪能夠顯著抑制冠心病大鼠心肌細胞的凋亡，且呈劑量依賴性，提示二氮嗪或可通過抑制細胞凋亡而緩解冠心病的進程。

Kir6.2是線粒體ATP敏感性鉀離子通道之一，本研究發現，二氮嗪能夠顯著促進Kir6.2的表達，且呈劑量依賴性，說明二氮嗪在體內有效促進線粒體ATP敏感性鉀離子通道的開放。在炎性反應中，ERK1/2信號通路的激活始于轉運和活化Raft，后者磷酸化激活 ERK1/2[18]。ERK 是一種絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，可將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，介導細胞生物化學反應，如凋亡、增殖、轉化等[19，20]。本研究發現，二氮嗪能夠顯著抑制冠心病大鼠心肌細胞ERK1/2的表達。

綜上所述，線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑二氮嗪能夠對心肌組織結構有顯著的保護作用，并且能夠緩解冠心病大鼠心肌細胞的凋亡，其作用機制可能為抑制體內炎性反應，以及降低冠心病大鼠心肌組織中ERK1/2的表達，從而抑制心肌細胞的凋亡，但具體的治療機制還需要進一步探討。