AMH對暴露于化療毒性下卵巢功能損傷的評估價值

李曉林 劉思旋 黃 潤 馬麗思 宗祥云

抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)為轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一員，是一種二聚糖蛋白，也稱為苗勒管抑制物質(Müllerian inhibiting substance，MIS)[1,2]。男性胎兒由發育中的睪丸產生AMH，可使苗勒管退化[3]。女性AMH主要由顆粒細胞產生，其表達開始于初級卵泡，在次級卵泡和小腔卵泡中達到峰值。但AMH在原始卵泡和閉鎖卵泡中幾乎檢測不到，其水平在卵泡發育的最后階段逐漸下降[4,5]。因此，在臨床應用中，血清AMH可作為評估卵巢儲備的一種標志物。既往的詳細研究證實血清AMH水平可作為體外受精(IVF)和多囊卵巢綜合征(PCOS)中卵巢儲備和卵巢功能障礙的定量標志物[6,7]。此外，AMH可能具有抑制原始卵泡向生長卵泡的招募和發育的作用[8]。

在年輕女性惡性腫瘤如淋巴瘤、婦科腫瘤、肺癌、乳腺癌患者中，其預后往往比老年患者差，病死率也較高[9，10]。包括具有生殖毒性藥物在內的化療方案常用于治療年輕惡性腫瘤患者，而環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)是最常用的細胞周期非特異性細胞毒性藥物之一，常對卵巢功能造成不可逆的損害。目前對環磷酰胺破壞卵巢卵泡的機制尚不清楚，但最近的研究表明，環磷酰胺通過DNA烷基化和破壞正常細胞過程直接損傷卵泡，并通過損傷顆粒細胞消耗原始卵泡[11]。在AMH缺乏的情況下，更多的原始卵泡發育為生長卵泡，卵泡耗竭加快[12，13]。

目前，尋找一種可靠的生物學標志物來預測化療后患者卵巢功能的損傷情況是十分必要的。雖然AMH已經應用于臨床卵巢功能的檢測，但由于血清AMH會受到很多因素的影響，所以一直存在爭議。研究表明，AMH作為卵巢儲備的生物學標志物與女性自然生育能力無關[14]。Dezellus證實絕經前乳腺癌患者化療后卵巢儲備發生快速改變，部分患者血清AMH水平會迅速恢復或保持平穩[15]。盡管在人類研究中有這些結果，但在CTX給藥10天后測定血清AMH與青春期后小鼠生殖細胞破壞程度(原始卵泡)無相關性[12]。有關AMH是否可用于化療后卵巢功能的評估成為最近研究的熱點[16]。本研究檢測了血清AMH在小鼠不同年齡組的變化，以及不同劑量環磷酰胺對荷瘤小鼠血清AMH及各級卵泡的影響，從而明確血清AMH在評估化療后卵巢儲備功能損傷中的意義。

材料與方法

1.實驗材料:(1)動物：4～6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠及BALB/c裸鼠，由上海交通大學附屬上海市第六人民醫院動物實驗中心提供[實驗動物許可證號：SCXK(滬)2017-0008]。標準飼料喂養，室溫15～25℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。動物實驗經醫學實驗動物管理委員會批準。(2)藥物與試劑：環磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，0.9%氯化鈉注射液購自安徽豐原藥業股份有限公司，戊巴比妥購自上海索萊寶生物科技有限公司，小鼠血清AMH-ELISA試劑盒購自上海優培諾生物科技有限公司。

2.實驗方法：(1)隨機選取15只野生型雌性C57BL/6J小鼠，分別為1、4、6、8、12月齡(每月齡 3只)，麻醉后心臟采血留取血清、卵巢進一步檢測。另外，隨機選取27只6周齡、體質量15～20g的雌性近交系BALB/c裸鼠，每組小鼠皮下注射1×107個MCF7細胞，每2天觀察并記錄腫瘤生長情況。8周齡時，將27只裸鼠隨機分為3組(9只/組)，分別單次腹腔注射0.9%氯化鈉注射液、CTX100mg/kg、CTX200mg/kg。藥物處理前每組隨機抽取3只小鼠，麻醉后心臟采血，留取卵巢。然后在化療后1、3周，每組隨機抽取3只小鼠，麻醉后心臟采血，留取卵巢。卵巢用甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(HE)。全血靜置1h后4℃過夜，離心后，吸取上清液。血清中 AMH 水平通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定。荷瘤小鼠實驗流程如圖1。(2)血清ELISA檢測：空白孔不加樣，只加顯色劑和終止液用于調零。標準品孔加入稀釋好的標準品50μl，然后加入酶標試劑50μl。樣品孔加入血清50μl，然后加入酶標試劑50μl。輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養箱中孵育60min。小心揭掉封板膜，洗滌液清洗5次，拍干。每孔加入顯色劑100μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min。每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。(3)卵泡計數：HE染色切片厚度為5μm，每隔5張計數一張片子，上下同一個卵泡不重復計數，并應用5倍校正因子來估計每個卵巢的卵泡總數。只記錄有卵母細胞核的卵泡。卵泡發育經過5個階段，即原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、腔卵泡和黃體卵泡階段。原始卵泡卵母細胞周圍只有一層扁平顆粒細胞。若觀察到周圍是單層立方顆粒細胞，則為初級卵泡。次級卵泡有多層立方顆粒細胞。如果在顆粒細胞層中觀察到腔，則將卵泡歸類為腔卵泡。黃體可見異常卵母細胞和多層粘連顆粒細胞時。初級卵泡、次級卵泡和腔卵泡統稱生長卵泡。

圖1 荷瘤小鼠實驗流程

結 果

1.正常小鼠各年齡組AMH水平及各組卵泡數目:為檢測不同年齡段C57BL/6J野生型雌性小鼠血清AMH水平及卵泡數量，分別留取了1、4、6、8、12月齡小鼠的血清及卵巢。可以看到血清AMH早期呈上升趨勢，隨著年齡的增長呈顯著下降趨勢(圖2)。根據小鼠AMH水平可將其生殖狀態分為3個階段。第1階段血清AMH水平在4月齡前明顯升高(P=0.000)。第2階段4～8月齡小鼠血清AMH水平相對穩定(4月齡vs 6月齡，P=0.28；4月齡vs 8月齡，P=0.98)。第3階段8月齡以上小鼠血清AMH水平顯著下降(P=0.000)，表現為小鼠月經周期不規則，進入圍絕經期。通過對卵泡計數的分析發現，隨著年齡的增長，原始卵泡數量呈下降趨勢，6～8月齡下降較為明顯(P=0.000，圖3 A)。6月齡前生長卵泡數量增加(r=0.91,P=0.000)， 6～8月齡保持穩定(r=0.91, 6月齡 vs 8月齡，P=0.21)， 8月齡后顯著下降(r=0.91,P=0.000，圖3B)。組織學表現見圖4。小鼠血清AMH水平與生長卵泡數量之間存在顯著相關性(圖5)。

圖2 正常小鼠不同年齡段血清AMH水平與4月齡比較，*P=0.000

圖3 正常小鼠不同年齡段原始卵泡與生長卵泡的數量變化與1月齡比較，*P=0.000;與4月齡比較，#P=0.000

圖4 不同月齡段小鼠卵巢HE染色(×200)A.1月齡；B.4月齡；C.6月齡；D.8月齡；E.12月齡

2.化療后荷瘤小鼠AMH水平及卵泡數目變化:為觀察不同劑量環磷酰胺對小鼠卵巢的損傷情況，分別留取了對照組、CTX100mg/kg組、CTX200mg/kg組荷瘤小鼠化療后不同時期的血清、卵巢。對照組及不同劑量化療組裸鼠腫瘤生長情況見圖6。3組荷瘤小鼠化療前腫瘤體積比較差異無統計學意義，且CTX100mg/kg組腫瘤生長與對照組比較差異無統計學意義，而CTX200mg/kg組腫瘤生長情況較為緩慢。BALB/c荷瘤裸鼠8周齡(化療前)、9周齡(CTX或0.9%氯化鈉注射液后1周)、11周齡(CTX或0.9%氯化鈉注射液后3周)血清AMH、原始卵泡及生長卵泡計數的變化趨勢見圖7、圖8。對照組小鼠血清AMH水平在8～11周齡無明顯變化，且各實驗組8周齡(化療前)小鼠血清AMH水平較為一致，差異無統計學意義。CTX200mg/kg組的AMH水平顯著下降(P=0.000)。而在CTX100mg/kg組中，AMH水平在9周時先略有上升，在11周時明顯下降。各組原始卵泡隨時間推移均呈下降趨勢(P=0.000)，且高劑量CTX組原始卵泡數量下降趨勢十分顯著。而各組生長卵泡的數量與血清AMH水平的變化均一致。由HE切片可以看到化療后第3周各組生長卵泡數量的情況，以及高劑量CTX下卵巢周圍組織的改變(圖9)。

圖5 小鼠血清AMH水平與生長卵泡數量的關系

圖6 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況

圖7 不同劑量CTX對荷瘤小鼠AMH的影響

圖8 不同劑量CTX處理對荷瘤小鼠卵泡數量影響

圖9 化療后第3周各組小鼠卵巢HE染色情況(×200)A.對照組；B.CTX100mg/kg組；C.CTX200mg/kg組

討 論

研究證實，隨著年齡的增長，生長卵泡中AMH的表達水平保持穩定[16]。因此，血清AMH水平的下降直接反映了卵巢生長卵泡數量的減少。Scheffer等[17]也認為生長卵泡的數量反映了女性和小鼠卵巢儲備。本研究觀察到生長卵泡的數量與原始卵泡以及血清AMH水平密切相關。在成熟小鼠中AMH水平和原始卵泡數量都隨著年齡的增長而呈持續下降趨勢。但是在8月齡以上的小鼠，血清AMH水平和生長卵泡數量均呈穩定下降趨勢，此前生長卵泡保持穩定或者增長趨勢。由此筆者認為一旦原始卵泡池大小達到一定閾值水平，維持生長卵泡池的補償機制可能不再有效。更重要的是，在生殖階段的后期，原始卵泡池的耗竭逐漸減緩，而生長卵泡數量的也在逐漸減少。這意味著原始卵泡的使用率在生殖階段早期是相對較低的，而在生殖階段后期有著更高的使用率。

2013年，Detti等[18]報道AMH不能很好地評估成年小鼠在青春期前暴露于CTX時的卵巢功能。此外，血清AMH水平無法預測環磷酰胺誘導的急性卵巢卵泡破壞。本研究發現血清AMH水平在前6個月是不斷升高的，之后隨著年齡的增長而下降。在未成熟的雌性小鼠和女性中，AMH水平隨著卵泡的生長而升高。此后，小鼠生殖早期生長卵泡數量保持不變，同時AMH水平不變。這表明補償機制是存在的，以保持不斷增長的卵泡的數量。因此，盡管原始卵泡池下降，血清AMH水平是恒定的。也有可能，相對較多的原始卵泡從卵泡池中被招募，以維持數量恒定的生長卵泡。因此，筆者的研究表明，血清AMH水平對于評估正常年輕小鼠卵巢儲備不夠準確和合適。

低劑量CTX對小鼠AMH水平的影響并不顯著，原始卵泡略有減少，生長卵泡一過性增多，然后減少，卵巢儲備功能的損傷程度較小。不同的是，高劑量CTX小鼠AMH明顯下降，原始卵泡數量明顯減少，生長卵泡數量也有下降。因此，血清AMH水平對化療導致的有限的卵巢儲備更為敏感，或者說在卵巢儲備充裕的個體其卵泡池的消耗無法通過AMH體現、而在卵巢儲備有限的個體血清AMH的波動則能忠實地反映卵巢儲備的流失，可用于評估化療藥物對卵巢儲備功能的損傷。

本研究的意義在于以下幾個方面：(1)驗證了小鼠血清AMH水平與原始卵泡及生長卵泡之間的關系，與生長卵泡的數量呈正比，當卵巢儲備下降到一定界值后，隨著原始卵泡的數量減少而降低。(2)明確了不同年齡段雌性小鼠AMH的分布，在成熟及年老的小鼠中，AMH更能反映其卵泡儲備的情況。(3)化療毒性不良反應下，AMH水平可以反映其卵巢儲備功能的損傷情況。