小檗堿通過NF-κB相關通路抑制AGEs誘導的小鼠小膠質細胞活化的實驗研究

萬瑾舒 顧 蓓 劉玉琴 南鳳尾 張孟仁

神經炎性反應是糖尿病認知功能下降的重要機制，減輕或有效抑制炎性反應可能是防治糖尿病認知功能障礙的重要途徑[1～3]。有研究表明，高糖狀態下，體內炎性因子水平的升高可能與小膠質細胞中非酶糖基化產生過多的晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)，從而引發晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE) 相關的胞內炎性信號通路有關[4，5]。AGEs可以與細胞表面 RAGE 結合，激活胞內炎癥信號通路并產生活性氧，同時，核轉錄因子 κB (nuclear factor-kappaB，NF-κB)磷酸化后入核，啟動下游基因轉錄，進而誘發炎癥，導致炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6 (interleukin-6，IL-6) 的釋放，從而對神經細胞造成損傷[6,7]。

黃連(Rhizoma Coptis)，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物， 是筆者課題組自擬中藥復方腦復聰的主要成分之一，現代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂等作用，小檗堿(berberine)是其主要的有效成分之一。本研究通過研究小檗堿對 AGEs 誘導小膠質細胞活化后引發的炎性反應的作用，探討小檗堿在糖尿病認知功能障礙中發揮神經保護作用的可能機制。

材料與方法

1.材料：小鼠小膠質BV-2細胞細胞株購自北京協和醫學院基礎學院細胞中心，編號:3111C0001CCC000063。RPMI-1640液體培養基、胎牛血清(FBS)、MTT(美國Sigma公司)，鹽酸小檗堿(百靈威科技有限公司)，AGEs蛋白質(北京博奧森有限公司)，DMSO(北京化工廠)，Anti-CD68抗體(ab53444，英國Abcam公司)，Anti-RAGE抗體(ab181293，英國Abcam公司)，pNF-κBp65 抗體(#3033T，美國CST公司)，TNF-α ELISA試劑盒(美國eBioscience 公司)，AGEs-BSA(美國Biovision公司)，Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙氨酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅(美國Sigma公司)，ECL Plus 超敏發光液(美國Millipore公司)，羊抗兔HRP 標記的二抗、羊抗大鼠HRP 標記的二抗(美國Jackson公司)。倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，ELX 800 酶標儀(美國BioTek公司)，全自動多功能酶標儀(美國Thermo公司)，CO2培養箱(美國Forma3111公司)，自動洗板機(美國Thermo公司)，電熱恒溫培養箱(中國DH4000A)，GL-802B微型臺式真空泵、MINI shaker、搖床(中國其林貝爾公司)，臺式冷凍離心機(中國湘儀公司)，電泳儀、轉膜儀(中國J-MAX公司)。

2.方法：(1)細胞培養：小鼠小膠質細胞BV-2以含10%FBS的RPIM1640培養基培養在37℃含5%CO2的細胞培養箱內，隔日換液1次，隔2～3日傳代一次(細胞長至70%～80%時傳代)。(2)細胞給藥與分組：取對數生長期BV-2細胞以3×104/ml的密度接種于6孔培養板，待細胞貼壁后，吸棄舊培養基，然后按分組更換培養基后繼續培養約24h后繼續后續實驗，(3)分組情況：Con組培養基為無血清的 RPMI1640 培養基，AGEs組為無血清的 RPMI1640 培養基+AGEs(終濃度為 300μg/ml)，小檗堿組更換為 10μmol/L 小檗堿預處理1h后再更換為 300μg/ml AGEs 培養基培養 23h，BSA陰性對照組為無血清的 RPMI1640 培養基+BSA(終濃度為 300μg/ml)。(4)細胞形態觀察及ELISA檢測：更換培養基繼續培養24h后倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化并攝片。細胞形態觀察結束后提取細胞上清液，采用TNF-α ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中TNF-α 含量。(5)細胞活力檢測：取對數生長期BV-2細胞以3×103/孔的密度接種于96孔培養板中，每孔加含10%FBS的RPMI1640培養基約100μl，每組設8個平行孔，外周1圈空白孔內加100μl 0.01mmol/L PBS做空白對照，細胞貼壁后按上述實驗分組給藥繼續培養24h后采用MTT對細胞活力進行檢測，選擇570nm波長在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，記錄并分析結果。(6)Western blot法檢測：采用Western blot法對各組細胞中CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白進行檢測，蛋白相對表達量用各目的蛋白灰度值與相應內參(actin)灰度值的比值表示。

結 果

1.小檗堿對小膠質細胞BV-2形態的改變:顯微鏡下可見:常規對照組細胞 50%～60%貼壁良好，胞體呈梭狀或三角狀，約 40%懸浮生長。AGEs 組細胞貼壁數量較Con組增多，約70%～80%貼壁，部分細胞活化為胞體較大、突起縮短的阿米巴樣類巨噬細胞(圖1)。BSA 對照組與Con組比較懸浮細胞比例相似，并且沒有出現阿米巴樣細胞，提示 AGEs 對小膠質細胞形態的改變與其蛋白屬性無關。小檗堿組較AGEs 組阿米巴樣細胞數目減少，多為梭形或三角狀細胞，提示小檗堿對 AGEs 導致的形態學改變有一定的恢復作用。

2.小檗堿對小膠質細胞BV-2細胞活力的影響:與Con組比較，AGEs組、小檗堿組及BSA組與Con組之間A值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖2。

3.小檗堿對小膠質細胞上清液中TNF-α分泌量的影響:與Con組比較，AGEs組上清液中TNF-α分泌量顯著升高(P=0.000)；與AGEs組比較，小檗堿組細胞上清液中TNF-α分泌量差異無統計學意義(P>0.05)；與Con組比較，BSA陰性對照組上清液中TNF-α分泌量差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖1 不同培養條件下小膠質細胞倒置相差顯微鏡下形態觀察(×40)A.Con組;B.300μg/ml AGEs 組;C.小檗堿組;D.BSA 對照組

圖2 各組小膠質細胞BV-2細胞活力比較(n=24)A.Con組;B.300μg/ml AGEs 組;C.小檗堿組;D.BSA 對照組

圖3 不同組小膠質細胞上清液中TNF-α分泌量(n=4)A.Con組;B.300μg/ml AGEs 組;C.小檗堿組;D.BSA 對照組

4.小檗堿對小膠質細胞CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白表達的影響:與Con組比較，AGEs組小膠質細胞中CD68、RAGE及pNF-κB p65蛋白的表達量均明顯升高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，小檗堿組CD68、pNF-κB p65蛋白的表達量均較AGEs組顯著下降(P<0.01，P<0.05)，RAGE蛋白的表達量與AGEs組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖4。

圖4 小檗堿對小膠質 細胞CD68、RAGE、pNF-κB p65 蛋白表達的影響

討 論

多項研究表明，AGEs 與糖尿病認知功能障礙關系密切，2 型糖尿病認知功能障礙患者血清 AGEs 水平明顯高于糖尿病非認知功能障礙患者[8，9]。AD 樣變病理改變是認知功能障礙的重要病理基礎，AGEs 與 AD 樣病理改變的發生、發展亦關系密切。AGEs 不僅常與 Aβ 共同沉積在AD患者/動物模型神經細胞外，同時參與并增加 Aβ 的錯誤折疊[10]。另外，Aβ-AGEs 復合物可通過 RAGE 相關信號通路加重 Aβ 的神經毒性作用[11]。Tau 蛋白過度磷酸化方面，在 AD 患者的神經原纖維纏結處同樣可檢測到 AGEs 的表達，另外，AGEs亦可通過RAGE介導的糖原合成酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)激活誘導 AD 樣 tau 蛋白改變[12]。上述研究均表明AGEs 與糖尿病認知功能障礙關系密切，在認知功能障礙發病過程中發揮重要作用，故本研究選用AGEs 為小膠質細胞激活劑，模擬高糖狀態下神經系統的炎癥激活后的細胞狀態。預實驗過程中通過觀察不同濃度下小膠質細胞細胞形態學變化、MTT、細胞免疫熒光及ELISA 檢測結果，同時結合相關文獻報道，筆者最終采用了 300μg/ml 作為 AGEs 實驗干預濃度。

有研究表明，AGEs可以與細胞表面RAGE結合，激活胞內炎癥信號通路并產生活性氧，同時，NF-κB磷酸化后入核，啟動下游基因轉錄，進而誘發炎癥，導致炎性因子 TNF-α、IL-6 的釋放[4，5]。本實驗結果顯示AGEs 能顯著上調小鼠小膠質細胞表面白細胞分化抗原68(cluster of differentiation 68,CD68)、RAGE、pNF-κB p65蛋白的表達，增加炎性因 子TNF-α的分泌量。本實驗的研究結果與其相一致。但AGEs 誘導的小膠質細胞激活及炎性因子釋放其具體機制到底是 AGEs 直接激活小膠質細胞導致 CD68 的表達增高，從而激活 RAGE/NF-κB 通路，增加炎性因子的釋放還是 AGEs 與其受體 RAGE 結合激活其下游 NF-κB 通路激活使炎性因子升高從而導致小膠質細胞的激活尚不清楚。該信號轉導通路中各信號分子之間相互影響的具體過程及機制尚待進一步分子生物學研究闡明。

根據認知障礙的中醫病因病機特點及治療認知障礙的臨床經驗并參考現代藥理學的研究，筆者設計的中藥復方腦復聰臨床應用對脾腎虧虛、痰濁血瘀型輕度認知功能障礙的患者有良好療效[6]。既往研究表明腦復聰能夠增加海馬CA1區胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的含量，下調糖尿病認知功能障礙大鼠海馬 CA1 區NF-κB的表達水平、有效抑制高糖條件下小鼠小膠質細胞的活化，NF-κB 的活力及 NF-κB p65 的表達，顯著下調 BV-2 上清液中的 IL-6、TNF-α 蛋白和 BV-2 中 IL-6-mRNA、TNF-α-mRNA 的表達[6，7]。

黃連作為該復方的組成藥物之一，其主要有效成分小檗堿在腦缺血、阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化、糖尿病認知功能障礙等多種中樞神經損傷性疾病中均能起到一定的神經保護作用[13]。因此，本實驗選用中藥黃連的有效成分小檗堿作為研究藥物。綜合小檗堿對小膠質細胞活化的抑制作用及其對炎性因子pNF-κB p65蛋白的下調作用，參考文獻[14～16]，本研究最終采用了 10μmol/L 的作用濃度。

本實驗研究結果顯示小檗堿對 AGEs 導致的細胞上清液中 TNF-α 的升高無明顯降低作用，這與于希忠等[17]和Lu等[18]所報道的小檗堿能抑制炎性反應、降低 TNF-α含量的研究結果不一致，推測實驗結果不一致的原因可能為小檗堿預處理時間不足或者更換培養基的過程使得細胞上清液中能降低 TNF-α 的有效成分流失有關。Western blot法檢測結果顯示，小檗堿可以顯著下調AGEs 培養的小膠質細胞CD68和pNF-κB p65 蛋白的表達，說明小檗堿可以抑制300μg/ml AGEs 培養條件下小鼠小膠質細胞的活化，其原因可能與其調控 NF-κB 相關信號通路有關。

本研究結果提示小檗堿可以通過抑制AGEs誘導的小鼠小膠質細胞的活化發揮神經保護作用，但具體機制尚待進一步實驗明確，希望能為探討小檗堿作為糖尿病認知功能障礙的防治藥物的可能機制及潛在靶點提供參考。