WNT9B基因新突變與子宮縱隔發生相關聯

李晟輝 馮 帆 褚春芳 駱黎靜 李 琳

人類生殖道畸形是女性常見的疾病，通常與苗勒管發育異常有關。子宮異常是生殖道畸形的一個亞類，包括子宮縱隔、始基子宮、雙角子宮等類型[1,2]。文獻報道女性生殖道畸形的發生率約為4%～7%[3,4]。女性子宮異常的發生率約為1%～6%[5,6]。子宮縱隔是最常見的子宮異常類型[7]。但子宮縱隔患者生育結果較差，患者流產率較高[8]。胚胎發育過程中，如果子宮正常發育，苗勒管生長到泌尿生殖竇后，導管融合進入頭側，形成厚隔，然后中隔的會再被吸收。子宮縱隔的發生與中隔的異常吸收有關。遺傳因素、環境因素、及其二者的相互作用是生殖道畸形發生的原因。其中遺傳因素在生殖道畸形發病機制中的作用尚不清楚。以往研究發現多個基因的突變或拷貝數變異與生殖道畸形或子宮異常發生相關，包括TBX6、HOXA13、HOXA10、WNT9B、EMX2、TP63、LHX1、PBX1、CRKL、RBM8A、PAX2、DACT1、MYCBP2等[9～25]，其中HOXA10和HOXA11基因突變與子宮縱隔的發生有關[26,27]。

以往研究子宮縱隔的遺傳致病基因時多應用候選基因重測序的方法，即對子宮縱隔患者的某個基因(例如HOXA10或HOXA11基因)行Sanger測序來發現潛在致病基因突變。近年來全外顯子組測序技術的發展使得很多疾病的遺傳學致病基因和突變得以被發現。因此本研究使用全外顯子組測序技術嘗試對6例子宮縱隔患者進行遺傳學分析，為了解應用全外顯子組測序技術尋找子宮縱隔患者遺傳致病突變的可行性。

對象與方法

1.研究對象：本研究納入6例子宮縱隔患者，分別命名為P1～P6。P1～P5患者均為完全子宮縱隔患者，P6為不完全子宮縱隔。P3患者合并完全陰道縱隔，P4患者合并不完全陰道縱隔，P6患者合并陰道縱隔和宮頸縱隔。所有患者均在首都醫科大學附屬北京婦產醫院就診，在征得患者知情同意后，將患者入組，并抽取患者EDTA抗凝外周血5ml。所有入組患者染色體核型分析均為正常的46;XX核型。

2.DNA提取：基因組DNA的提取使用康為世紀公司的血液基因組柱式小量提取試劑盒(貨號：CW2087S)，并按照說明書步驟提取DNA。

3.全外顯子組測序分析：全外顯子組測序由安諾優達基因科技(北京)有限公司完成，實驗方法參考本課題組以往發表文獻[28]。實驗流程：使用AgilentV6外顯子靶向序列富集系統對全外顯子組序列進行捕獲，富集到的序列通過HiSeq測序平臺進行雙端測序(PE150)。目標區域覆蓋度為99%以上，目標區平均深度高于20×的比例占所有測序深度的98%。患者原始測序數據通過比對軟件BWA定位到人參考基因組UCSC hg19中，得到BAM格式比對結果文件。通過使用突變分析軟件GATK分析出所有變異位點，并通過ANNOVAR軟件對于所有變異位點進行功能注釋。

4.Sanger測序驗證突變位點：Sanger測序是為了再次確認WNT9B突變在患者中存在。驗證c.71A>G上游引物序列為：5′-TGAGCGGCGCGAGGAGATGCTA-3′；下游引物序列為：5′-CATCAGAGAG-CGGGACTGACGCCT-3′。驗證c.832T>A上游引物序列為：5′-TCCCCCACAGGCTGTGAAGAGTG-3′；下游引物序列為：5′-GGCTTGCTGGGCAGTAGGCCTAG-3′。PCR擴增使用上海翊圣生物科技有限公司的高保真DNA聚合酶，PCR退火溫度為61℃。Sanger測序反應交由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

5.蛋白質序列比對分析：蛋白質序列比對分析使用CLC基因組工作臺軟件(第10版本)。每個物種的NCBI蛋白質序列號如下：人，NP_003387；大鼠，NP_001100525；小鼠，NP_035849；斑馬魚，NP_001131132；非洲爪蟾，NP_001096553。

6.在線突變蛋白致病性預測分析：Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)：預測值的范圍是從0～1，數值越高致病可能性越大。Sorting Intolerant From Tolerant(SFT)(https://sift.bii.a-star.edu.sg/)，預測值從0～1，數值越接近或等于0被認為越致病。PROVEAN(http://provean.jcvi.org/index.php)：預測值<-2.5被認為該變異是有害的。Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)：數值代表預測的可能性，數值越接近1代表預測越準確。SNPs&GO(http://snps.biofold.org/snps-and-go/snps-and-go.html)：數值>0.5被認為可能致病。PhD-SNP(http://snps.biofold.org/phd-snp/phd-snp.html)：數值>0.5被認為可能致病。

7.在不同數據庫中查看等位基因頻率：外顯子聚集數據庫(ExAC，http://exac.broadinstitute.org/)；千人基因組數據庫(1000 Genomes，http://browser.1000genomes.org/)；基因組聚集數據庫(gnomAD，http://gnomad-old.broadinstitute.org/)。

8.蛋白質二級結構預測：本研究應用PSIPRED進行蛋白質二次結構預測。PSIPRED使用多達4個前饋神經網絡和PSI-BLAST輸出生成二級結構預測，PSI-BLAST用于查找相關序列并構建位置特定評分矩陣。序列概況的產生由PSI-BLAST完成。此配置文件由PSIPRED規范化。初始二級結構的預測由神經網絡完成。第二神經網絡用于過濾第一網絡的預測結構。PSIPRED預測結果為得分最高的二級結構。

9.蛋白質同源模建：SWISS-MODEL是一種基于網絡的蛋白質結構同源建模過程，模型搭建過程基于ProMod3。構建同源蛋白模型主要包含以下4個步驟：①目標序列與模版序列的比對；②模版結構序列的確定與鑒別；③模型搭建；④模型質量評估。這些步驟需要經過與最新的蛋白質結構數據庫進行比對，同時在每一步都需要交互式的反復地進行篩選優化，從而得到一個令人滿意的模型搭建結果。

結 果

1.全外顯子組測序分析：本研究對6例子宮縱隔患者行全外顯子組測序，測序數據比對后，對結果進行篩選。只保留等位基因頻率>3%的錯義變異、無義變異、移碼變異及剪接位點變異。在這些基因中，本研究重點關注以往研究中發現的與生殖道畸形有關的基因，即TBX6、HOXA13、HOXA10、WNT9B、EMX2、TP63、LHX1、PBX1、HOXA11、HOXA7、PAX2、RBM8、CRKL、HNF1B等。因此查看這些生殖道畸形相關基因在6例患者中的突變情況，發現WNT9B基因在患者P2和P6中分別發生罕見變異c.832T>A;p.S278T和c.71A>G;p.Y24C。然后使用Sanger測序驗證了這兩個變異，發現患者P6攜帶c.71A>G變異(圖1A)，患者P2攜帶c.832T>A變異(圖1B)。

圖1 WNT9B變異的Sanger測序分析和保守性分析A.Sanger測序確認患者P6攜帶c.71A>G變異，對照不攜帶該變異;B.Sanger測序確認患者P2攜帶c.832T>A變異，對照不攜帶該變異;C.變異的保守性分析。Y24位點在從人到非洲爪蟾的不同物種中非常保守，但S278位點在演化中不保守。紅色箭頭指示差異位置

查詢ClinVar數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)，但在該數據庫中未發現本研究發現的WNT9B突變。由于無法獲取患者父母的樣本，因此無法分析突變是如何遺傳的。

2.變異的致病性分析：首先這兩個變異非常罕見，c.71A>G變異ExAC、gnomAD和千人基因組數據庫中的頻率均為0。多個在線的突變蛋白致病性預測軟件認為p.Y24C是致病性突變，但p.S278T可能為非致病性變異(表1)。保守性分析亦支持上述觀點，顯示Y24位點在不同物種中非常保守，但S278位點并不保守(圖1C)。因此，以上分析表明p.Y24C很可能是致病性突變，但p.S278T的致病性較弱。

表1 WNT9B變異的致病性分析

Polyphen-2.第2版多態性表型工具；SIFT.從耐受突變中篩選不耐受的突變工具；PROVEAN.蛋白質變異效應分析工具；MutationTaster.突變鑒別工具；SNPs&GO.用GO術語預測疾病相關變異工具；PhD-SNP.人類有害單核苷酸多態性的預測因子工具；ExAC.外顯子組聚集數據庫；1000G.千人基因組數據庫；GnomAD.基因組聚集數據庫。D代表致病；N代表中性變異；P代表基因多態性；B代表良性變異

3.變異的結構生物學預測分析：經過檢索未發現WNT9B蛋白有已知結構，因此本研究只能通過蛋白質二級結構預測和三級結構同源模建來對突變位置進行預測和模擬。首先研究通過PSIPRED方法對WNT9B蛋白質二級結構進行預測，發現Y24位點位于1個α-螺旋中，S278位于1個β折疊中(圖2)。接著對WNT9B進行三級結構同源模建，但由于該蛋白N端沒有同源已經解結構的模型，無法進行同源模建，因此Y24位點無法得到三級結構預測圖像。進而通過SWISS-MODEL軟件對WNT9B蛋白C端結構進行同源模建。通過模擬結構可以發現S278位于接觸面上(圖3A)，S突變為T之后碳鏈會延長，因此可能會導致新生成的T氨基酸與其下面的α-螺旋上的氨基酸殘疾側鏈產生新的相互作用(圖3B)。

圖2 WNT9B蛋白的二級結構生物學分析WNT9B蛋白的二級結構分析，藍色圓筒代表α-螺旋，長方形代表β折疊,紅色星號*代表突變氨基酸位點。Y24C位于一個α-螺旋中，S278T位于一個β折疊中

圖3 WNT9B蛋白的三級結構生物學同源模建分析A.WNT9B蛋白的C端的同源模建分析(表面圖)。紅色箭頭指示S278位點。B. WNT9B蛋白的C端的同源模建分析(卡通圖)。紅色線條顯示放大區域，紅色箭頭指示S278位點

討 論

本研究通過對6例子宮縱隔患者行全外顯子組測序，發現兩例患者分別攜帶WNT9B基因罕見變異。其中p.Y24C變異被預測為致病性突變，而p.S278T變異被認為可能是非致病性變異。

人WNT9B基因位于染色體17q21.32區域，由6個外顯子組成。WNT基因家族由高度保守的發育控制基因組成，該基因編碼分泌的糖蛋白在胚胎發育過程中參與胚胎建成的信號轉導。小鼠Wnt9b基因在沃爾夫管上皮中表達，并且對繆勒氏管的尾部延伸至關重要。研究還發現Wnt9b在發育中的泌尿生殖系統中作用于Wnt4的上游。Wnt9b對于早期誘導后腎間質是必需的。此外表達Wnt9b的細胞可以在功能上替代輸尿管芽。輸尿管芽通過分泌可溶性生長因子Wnt9b向后腎間質發出信號，Wnt9b通過β-catenin誘導后腎間質中Fgf8、LIM同源盒基因Lhx1和Wnt4的表達。Wnt4誘導后腎間質細胞進行間質-上皮轉化(MET)并分化為腎單位上皮。在沃爾夫管中Wnt9b誘導的MET受到HNF1B基因的調控。除了在MET中的作用外，Wnt9b對于后期腎臟形態建成是必須的。因此綜上所述，Wnt9b來源于沃爾夫管，并且對于管的延伸是必須的。

Wnt9b基因敲除雌性小鼠缺乏子宮和上陰道，但卵巢正常，這與人類MRKH綜合征表型相近。因此WNT9B基因突變亦可能與女性生殖道畸形發生有關。Wang等[29]在MRKH患者中發現兩個WNT9B突變。Waschk等[14]在109例MRKH綜合征和117其他子宮畸形患者中發現5例MRKH患者和1例雙角子宮患者攜帶不同的WNT9B基因突變。而本研究則首次在子宮縱隔患者中發現WNT9B基因突變。子宮縱隔的發生多是因為子宮中隔的異常吸收而導致的畸形，較MRKH綜合征(先天性無陰道無子宮)的畸形程度輕微。由于本研究使用全外顯子組測序技術，通過測序結果可以得知攜帶此WNT9B基因突變的患者未發現同時攜帶可能導致子宮縱隔的其他基因突變。其中p.Y24C突變被6個在線功能預測程序中的5個認為是致病性變異，結構生物學預測發現Y24位于一個α-螺旋中，Y24突變為C，可能會產生新的分子內或分子間二硫鍵從而影響蛋白質三維結構。因此p.Y24C突變可能為致病性基因突變。p.S278T變異則被所有程序認為是非致病性變異，但三維結構同源模建發現S278突變為T之后碳鏈會延長，可能會導致新生成的T氨基酸與其下面的α-螺旋上的氨基酸殘疾側鏈產生新的相互作用。因此雖然p.S278T被生物信息學預測為非致病性變異，但結構生物學預測其有可能產生不良影響。

本研究認為全外顯子組測序的強大之處在于其高通量性，這比候選基因重測序每一次只能關于一個基因或少數幾個基因要高效很多。本研究僅通過對6例患者測序就發現2例攜帶WNT9B基因變異，這表明全外顯子組測序在發現疾病致病基因突變上是一個強大的工具。對于另外4例患者，目前尚未發現可疑基因突變，但是隨著生殖道發育生物學的發展，更多基因功能逐漸被闡明，亦可能在4例患者中鑒定到新的基因突變。當然，本質上不是所有患者都是因為遺傳因素發病，全外顯子組測序甚至全基因組測序的應用則是盡可能地找到那些遺傳致病因素。本研究的不足之處在于未對p.Y24C和p.S278T變異的致病性做更深入的分子細胞生物學等功能性研究。因此本課題未來的研究重點是揭示這兩個變異是否引起WNT9B蛋白功能的改變。

綜上所述，本研究通過使用全外顯子組測序技術在6例子宮縱隔患者中發現兩個WNT9B基因的罕見變異。通過生物信息學及結構生物學預測分析筆者認為p.Y24C可能是致病性基因突變。