Reg3β干擾載體的構建及在H9C2心肌細胞中的鑒定

易 波 蔡玉立 李俊峰 包 艷 陳小琳 文重遠

心血管疾病是嚴重危害我國人民群眾生命健康的慢性非傳染性疾病之一，但目前仍缺乏有效的干預手段[1]。再生基因蛋白3β(regenerating islet-derived protein 3 beta，Reg3β)是新近發現具有抗炎和抗凋亡作用的分泌性蛋白，結構上屬于C型凝集素家族，其基因序列具有保守性[2～5]。在自身免疫性心肌炎、缺血性心臟病和心肌肥厚等動物模型中，Reg3β僅在心肌細胞中表達增多，而心臟組織非心肌細胞中均無表達[3,6,7]。研究發現，Reg3β不僅與心力衰竭患者的心功能分級和急性冠狀動脈綜合征(ACS)患者心肌炎性反應強度相關，還能預測心血管死亡風險，更能修復大鼠心臟功能、改善心肌梗死預后[3，6，8]。提示Reg3β不僅是心血管疾病的臨床評估和預后的生物學標志物，還具有潛在的心肌保護功能，具有廣闊的臨床應用前景。

因此，本研究擬構建Reg3β干擾載體，并在H9C2大鼠心肌細胞中優化轉染條件，鑒定抑制效果，為深入探索Reg3β在心血管疾病的作用提供有利的工具。

材料與方法

1.實驗材料：大鼠心肌細胞H9C2來源于武漢大學人民醫院中心實驗室。Reg3β-shRNA由上海吉瑪公司合成，pG1.2空白載體由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司提供，該載體含有增強綠色熒光蛋白(EGFP)。感受態細胞大腸桿菌DH5α及無內毒素質粒提取試劑盒來源于北京康為世紀生物科技有限公司。反轉錄cDNA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。DNA引物由上海吉瑪公司合成；質粒測序由深圳華大基因研究院完成。Lipofectamine2000、Lipofectamine3000轉染試劑和Opti-MEM培養基均來源于美國Invitrogen公司。羊抗大鼠Reg3β抗體購自美國R&D公司(貨號AF1996)，抗鼠β-actin抗體、抗羊二抗、抗小鼠二抗均購自北京四正柏生物科技有限公司。

2.Reg3β干擾表達載體的設計與篩選：檢索GeneBank以獲取大鼠Reg3β mRNA基因全序列(RefSeq ID：NM_053289.1；Gene ID：24618)，從起始密碼子AUG快開始尋找“AA”二連序列，以其3′端的19個堿基序列為潛在的siRNA靶點。據此選出3條合適的目標序列及其抑制靶點和1條空白對照序列由上海吉瑪公司合成基因片段。隨后將合成的siRNA以脂質轉染法轉染至H9C2心肌細胞中，以實時熒光定量PCR檢測Reg3β mRNA表達量，以此計算3條干擾片段的抑制率[抑制率(%)=(1-各組Reg3β變化倍數)×100%]，從而篩選合適的基因片段用于構建shRNA(表1)。

3.shRNA表達載體的構建：根據pG1.2表達質粒的要求，在干擾片段5′端加入一個SacⅠ的酶切位點(GAGCTC)，3′端加入LOOP環序列(TTCAAGACG)，接著加入其反向互補序列，最后加上終止密碼子序列TTTTTTG、SacⅠ酶切位點和BsaⅠ酶切位點。按照同樣方法得到其反義鏈序列。隨后將前述正義鏈和反義鏈于94℃退火成雙鏈DNA，同時利用BsaⅠ酶切pG1.2質粒得到線性化載體，將兩者在T4連接酶作用下進行連接反應。

4.shRNA表達載體的驗證：將10μl前述連接產物轉化至感受態大腸桿菌DH5α，并均勻涂布與含有卡那霉素的篩選培養板上，挑取數個單克隆菌落接種于5ml含卡那霉素抗性的LB培養液中擴增，提取質粒后使用SacⅠ酶切鑒定，并將酶切鑒定正確的質粒進行測序驗證。

5.H9C2大鼠心肌細胞培養：參考美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)建議，大鼠H9C2心肌細胞置于含4.5g/L葡萄糖和10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)的DMEM培養基(美國HyClone公司)中，在37℃和5% CO2培養箱中培養，于細胞密度在80%～90%時進行傳代。取對數生長期且生長狀態良好的H9C2細胞，以每孔3×105個細胞數接種于6孔板內，培養過夜后進行后續實驗。

6.shRNA表達載體的轉染條件優化：轉染前2h將細胞培養液換成無血清DMEM培養基。用opti-MEM培養基分別稀釋質粒和Lipofectamine2000或Lipofectamine3000，混勻后室溫靜置5min。Lipofectamine2000和Lipofectamine3000轉染試劑均以質粒∶轉染試劑=1μg∶2μl和1μg∶3μl的比例配置配制質粒-脂質體復合物250μl，靜置20min后加入H9C2細胞內輕輕混勻。6h后吸出復合物，換入正常培養基進行培養，48h后于倒置顯微鏡下觀察EGFP自發熒光強度以明確轉染效率。

7.H9C2細胞內干擾效果鑒定：轉染共分成3組,即空白組、pG1.2-Reg3β shRNA組和shRNA對照組，每組3個復孔。6孔板中接種H9C2細胞后，按shRNA最優轉染條件，依次加入無血清培養基250μl、pG1.2-Reg3β shRNA混合物250μl、pG1.2空白載體混合物250μl。繼續培養48h后提取細胞進行Reg3β mRNA和蛋白檢測。

8.q-PCR檢測Reg3β mRNA表達量：以Trizol法(美國Ambion公司)提取細胞總RNA并檢測其濃度后反轉錄成cDNA，以SYBR Green Master Mix進行PCR擴增得到各種Ct值，反應條件為50℃ 2min，95℃預變性10min，95℃變性30s，60℃退火30s，共40 個循環。大鼠β-actin引物序列為上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′；下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，大鼠Reg3β引物序列為上游引物：5′-GCTCCTACTGCTATGCCCTGTT-3′；下游引物：5′-TTACTCCACTCCCATCCACCTC-3′。以β-actin為內參，以2-ΔΔCt法計算各組Reg3β mRNA表達量相對于對照組表達量的變化倍數即為Reg3β mRNA相對表達量。

9.Western blot法檢測Reg3β蛋白表達量：以RIPA裂解液常規提取細胞總蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液后于100℃變性蛋白。上樣后經15%分離膠和濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉移至0.22μm PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1h，依次加入Reg3β和β-actin一抗(稀釋比均為1∶1000)及相應二抗進行孵育，以超敏ECL法進行顯色。

10.統計學方法：采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行統計分析：多組間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，組間比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.靶向Reg3β mRNA的干擾片段篩選：如表1所示，設計的3條shRNA分別針對Reg3β mRNA第159～178位堿基、第195～214位堿基和第284～303位堿基，其抑制率分別位67.93%、28.14%和36.19%。因此，選擇抑制率最高的第一條干擾序列(即Reg3β shRNA-1)為基礎構建shRNA。

表1 Reg3β shRNA基因片段序列、靶點及抑制率

2.Reg3β-shRNA表達載體的酶切和測序鑒定：因pG1.2質粒里面只有一個SacⅠ的酶切位點，因此在構建Reg3β-shRNA時于干擾片段前加入另一個SacⅠ的酶切位點，當質粒被SacⅠ酶切出一條約600bp DNA條帶時，說明退火片段連接到pG1.2載體里。酶切結果顯示Reg3β-shRNA經SacⅠ酶切后與預期結果一樣出現600bp的條帶(圖1)。測序結構證實構建的Reg3β-shRNA與實驗設計序列一致，且干擾片段前有SacⅠ酶切位點(GAGCTC)，詳見圖2。

圖1 pG1.2-Reg3β shRNA酶切驗證

圖2 pG1.2-Reg3β shRNA測序驗證

3.H9C2心肌細胞轉染條件優化：將兩種轉染試劑和Reg3β shRNA以不同比例混勻，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察，結果發現Lipofectamine3000(1μg∶3μl)的轉染效率最高可達50%，而Lipofectamine2000的轉染效率均不足10%(圖3)。

圖3 不同條件下pG1.2-Reg3β shRNA轉染H9C2的熒光顯微鏡圖(×40)

4.H9C2細胞內Reg3β 干擾效果評估：將Reg3β shRNA按最優條件轉染至H9C2細胞，48h后以q-PCR和Western blot法鑒定干擾效果(圖4)。與空白組比較，Reg3β shRNA可使mRNA相對表達量下降60%以上(P<0.01)，Reg3β蛋白表達量下降50%左右(P<0.05)，而shRNA對照組不抑制Reg3β表達(P>0.05)。

圖4 q-PCR和Westem blot法評估pG1.2-Reg3β shRNA抑制效果

討 論

隨著人們飲食結構及生活方式的改變，糖尿病、肥胖、高脂血癥、高血壓等心血管疾病高危因素流行趨勢明顯，在今后較長的時間內，心血管疾病患病人數將會急劇增加[1, 9]。因此，及時針對心血管疾病開展發病機制、診斷、干預治療的相關研究，有助于提高患者生命質量，有著重要的臨床價值和社會意義。

Reg3β是具有進化保守性分泌蛋白。大鼠Reg3β位于4q33(NC_005103.4),含6個外顯子，共編碼188個氨基酸；小鼠Reg3β位于6C3(NC_000072.6),含6個外顯子編碼175個氨基酸。在人體中該蛋白又稱為Reg3A(再生基因蛋白3A，Regenerating Islet-Derived Protein 3-Alpha)，位于2p12(NC_000002.12)，含6個外顯子，編碼175個氨基酸。人Reg3β與大鼠Reg3β具有72.99%的基因序列一致性，與小鼠Reg3β的基因序列一致性為75.1%，氨基酸序列一致性為70%，與小鼠Reg3α、Reg3γ、Reg3δ等其他家族成員的氨基酸序列一致性低至50%[10]。研究表明，針對重組人Reg3β蛋白設計的抗體能與小鼠Reg3β具有交叉反應，證實Reg3β在不同物種中可能具有類似的分子結構基礎[4,10]。因此，研究大鼠Reg3β的功能有助于深入理解該蛋白在人體中的潛在作用。

Reg3β雖然在體內許多組織和細胞均有表達，但在心血管疾病中僅特異性表達于心肌細胞，具有潛在的心肌保護作用。生理狀態下，Reg3β僅表達于小腸、胰島α細胞、分泌生長激素的細胞、子宮等組織。在某些疾病時許多組織會高表達Reg3β蛋白，例如急性胰腺炎時的胰腺組織、糖尿病大鼠胰島組織、再生的胰島β細胞、腫瘤組織、受損的神經組織等[4]。在自身免疫性心肌炎、缺血性心臟病和心肌肥厚等動物模型中，Reg3β僅在心肌細胞中表達增多，而心臟組織非心肌細胞中均無表達[3,6,7]。研究發現，Reg3β能誘導巨噬細胞向心肌受損部位浸潤以清除中性粒細胞殘骸，進而修復心臟功能，提高小鼠梗死后存活率[3]。雖然既往研究證實Reg3β既能減少TNF-α、IL-1β和細胞黏附分子的表達，又能抑制β細胞和胰腺癌的凋亡，但其是否通過抗炎和抗凋亡作用而保護心肌細胞仍有待深入研究[2,4,5,11]。

目前研究Reg3β功能及機制的常用方法是外源性Reg3β蛋白干預、Reg3β全身敲減小鼠、Reg3β過表達小鼠、以及下游gp130/JAK2/STAT3信號通路抑制劑等[3～5,12]。RNA干擾技術可介導細胞內序列特異的靶基因表達沉默，產生相應的功能表型缺失的現象，為探索Reg3β功能及機制提供了新的維度。因此，本實驗采用pG1.2干擾表達載體，帶有EGFP綠色熒光標記和CCDB基因，其中EGFP用于細胞內觀察shRNA表達情況，CCDB基因可用于篩選線性化的載體。本研究利用設計的3條Reg3β siRNA，篩選出抑制效率最高達到67.93%的抑制序列，進而成功構建了pG1.2-Reg3β shRNA沉默載體，既能瞬時轉染細胞以短暫的降低Reg3β的表達，也希望包裝成病毒表達載體感染細胞以獲得穩定表達株。

大鼠H9C2細胞是研究心肌細胞功能的常用細胞株之一，既能用于研究心力衰竭相關基因如基質金屬蛋白酶-2的作用，還能用于心肌細胞凋亡和細胞毒性研究[13]。此外，在H9C2細胞中，高濃度葡萄糖能誘導凋亡和炎性反應，并能夠觀察到降糖藥物二甲雙胍和腸促胰素樣肽(GLP-1)受體激動劑的心肌保護作用[14, 15]。但早期研究發現，在陽離子脂質轉染體模型下，H9C2細胞轉染效率遠低于HEK293細胞，影響了該細胞的科研應用[13]。因此，為獲得高效無毒的H9C2細胞轉染方法，筆者優化摸索兩種常用陽離子脂質體Lipofectamine2000和Lipofectamine3000的轉染條件，結果發現pG1.2-Reg3β shRNA沉默載體：Lipofectamine3000比例為1μg∶3μl時，其轉染效率可達到50%，明顯高于其他轉染模式。倪銀蕓等[13]研究發現，Lipofectamine3000細胞毒性小，轉染EGFP-LC2質粒的效率也顯著高于Lipofectamine2000、FuGen HD和DNA-In CRISPR等3種轉染方法，推薦用于H9C2細胞的轉染。

在此基礎上，本研究以最優轉染條件將成功構建的pG1.2-Reg3β shRNA沉默載體轉入H9C2細胞，PCR和Western blot法檢測結果顯示，Reg3β表達的抑制率可達到50%以上。但本研究也存在一定的局限性，如pG1.2-Reg3β shRNA抑制效果僅為50%以上，酶切驗證時未能將同時將空白載體和pG1.2-Reg3β shRNA放在一起進行驗證，細胞轉染條件需要進一步優化，亦未能在病理條件下(如高血糖)觀察該載體的抑制效果。無論如何，本實驗成功構建的pG1.2-Reg3β shRNA有望為后續深入探討Reg3β在心血管疾病中的作用奠定了基礎。