rAAV9介導HIF-1α對糖尿病小鼠缺血后處理的影響

李佳馨 李 鑫 吳建江 陳思宇 王 江

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)即由多種炎性介質與效應細胞共同參與，呈級聯放大的炎癥繼發性損傷和彌漫性肺實質損傷。而心肌缺血/再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷時氧化應激釋放大量氧自由基及炎性細胞因子作用于肺部，是造成ALI的重要原因[1,2]。研究表明，缺血后處理(ischemic post-conditioning, IPostC)不僅對接受后處理的缺血/再灌注損傷的心肌有保護作用，而且對遠隔器官肺也有相同效應，而其緩解心肌I/R所致ALI，發揮圍術期肺保護的機制可能與抑制氧自由基積聚、減少炎性細胞因子釋放以及激活HIF信號通路相關[3,4]。然而，筆者的前期研究結果發現，糖尿病狀態下HIF信號通路受損更加嚴重[5]。此時IPostC圍術期肺保護作用是否存在及其發揮效應的機制亟待進一步闡明。此外，重組9型腺相關病毒rAAV9(recombinant adeno-associated virus-9, rAAV9)載體介導HIF-1α基因，可以外源性上調HIF-1α基因，修復糖尿病狀態下損傷的HIF信號通路。因此，本研究通過建立糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷模型及心肌缺血后處理模型，觀察炎性細胞因子、氧自由基以及HIF信號通路在心肌I/R致ALI病程進展中的作用；探索外源性提高HIF-1α表達后IPostC對糖尿病心肌I/R致ALI的肺保護作用的機制。

材料與方法

1.實驗動物與分組：成年雄性糖尿病db/db小鼠40只，體質量55～65g(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，飼養于新疆醫科大學SPF級動物實驗中心，并通過新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗醫學倫理學委員會批準。按隨機數字表法分為假手術組(S組)、缺血/再灌注組(I/R組)、缺血后處理組(IPostC組)、rAAV9-HIF-1α+缺血后處理組(HIPostC組)，每組10只。

2.動物模型制備：心肌缺血/再灌注損傷模型建立(I/R組)：小鼠腹腔注射氯胺酮(8mg/100g)、甲苯噻嗪(2mg/100g)和阿托品(0.12mg/100g)(即KXA混合液)麻醉，行氣管插管，呼吸機輔助呼吸(頻率90～110次/分，潮氣量0.3～0.4ml)，小鼠仰臥固定于恒溫墊(36℃)操作臺上，消毒手術區域，雙目顯微鏡下于左側第3、4肋間開胸，結扎冠狀動脈左前降支缺血1h，位置為左心耳下緣約1mm處，后松開結扎線再灌注15min。結扎成功顯示心前區變白，心電圖示ST段抬高(T波高聳，QRS波增寬、變高)；再灌注成功標志為ST段回落，心尖復紅。假手術組(S組)：相同部位開胸、穿線但不結扎。缺血后處理模型建立(IPostC組、HIPostC組)：缺血1h后，灌注5min、缺血5min連續重復3個循環，后再灌注15min；HIPostC組于缺血后處理前進行尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α。

3.尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α：構建重組病毒載體rAAV9-HIF-1α(美國Virovek公司)，從尾靜脈注射進入db/db小鼠體內，根據Chen等[6]研究，采用劑量為2.0×1011微克/只小鼠，并于4～5周后處死小鼠，以保證病毒注射最佳劑量和最優表達時間。

4.肺組織病理學檢查：各組db/db小鼠建模完成后，取左肺于4%多聚甲醛中固定24h，石蠟包埋，HE染色采用蘇木素染液(福州邁新生物技術開發有限公司)、伊紅染液(北京中杉金橋生物技術有限公司)，切片，×400鏡檢。肺損傷程度采用Smith評分體系綜合評定[7]。

5.炎性細胞因子檢測：采用流式微球捕獲芯片技術(CBA法)檢測促炎性細胞因子白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)及抗炎性細胞因子白細胞介素-10(IL-10)。

6.氧自由基檢測：采用丙二醛MDA試劑盒及超氧化物歧化酶SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別檢測脂質代謝產物丙二醛(MDA)、氧自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)。

7.Western blot法檢測：各組db/db鼠再灌注結束后，取右肺，快速液氮冷凍，后移入-80℃冰箱凍存備用，稱重取約100mg樣本加400μl RIPA裂解液(武漢博士德生物工程有限公司)，于冰上研磨充分混勻，4℃ 12000r/min離心15min取上清液提取蛋白。Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)(北京全式金生物技術有限公司)測定蛋白濃度，后加入5×SDS-PAGE緩沖液，100℃水浴加熱5min使蛋白變性，12000r/min離心5min取上清待加樣。制膠、加樣、電泳后轉移至0.45μm PVDF膜上，室溫封閉1h，加入一抗HIF-1α抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司)，4℃孵育過夜，加入二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(英國Abcam公司)，室溫孵育1h，漂洗顯色后用ChemiScope mini化學發光儀檢測、拍照。以HIF-1α條帶灰度值與內參(β-actin)條帶灰度值的比值反映HIF-1α的表達。

結 果

1.肺組織形態學變化：光鏡下觀察，與S組比較，I/R組肺損傷程度顯著增高，表現為肺泡壁增厚、水腫、充血及出血，部分肺組織間質細胞增生、增大且增多，胞質深染，較多急慢性炎性細胞浸潤，部分肺泡萎縮、變小，肺組織大量出血、實變，部分細支氣管上皮細胞輕度增生；IPostC組缺血后處理后肺泡壁水腫、斷裂及出血情況僅有輕微緩解，但HIPostC組肺組織損傷程度顯著降低，肺泡壁結構基本完整，出血情況顯著減少。提示糖尿病心肌缺血/再灌注致急性肺損傷模型建立成功，糖尿病狀態下，缺血后處理對心肌缺血/再灌注致急性肺損傷的肺保護作用不明顯，但結合rAAV9-HIF-1α后對于已受損肺組織確有一定的保護作用(圖1)。

圖1 db/db小鼠肺組織病理切片(HE，×400)

2.肺組織HIF-1α的表達：Western blot法結果顯示，與S組(0.449±0.030)比較，I/R組(0.549±0.025)和IPostC組(0.656±0.026)的肺組織HIF-1α含量升高(P<0.05)，與I/R組比較，IPostC組的肺組織HIF-1α含量升高(P<0.05)；與IPostC組比較，HIPostC組(0.702±0.064)的HIF-1α含量明顯增高(P<0.05)；提示在糖尿病心肌缺血/再灌注后急性肺損傷時HIF-1α表達受影響，單純應用缺血后處理對于HIF-1α提高有幫助，而rAAV9-HIF-1α+缺血后處理可以明顯提高HIF-1α的含量(圖2)。

圖2 肺組織HIF-1α Western blot法條帶圖及柱狀圖

3.炎性細胞因子含量：與S組比較，I/R組和IPostC組的促炎性細胞因子IL-6和TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，IPostC組的促炎性細胞因子含量降低，但與S組比較含量仍然很高(P<0.05)；而與IPostC組比較，尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后HIPostC組的促炎性細胞因子IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)；與S組和I/R組比較，HIPostC組的抗炎性細胞因子IL-10的含量顯著增高(P<0.05)；提示單純應用缺血后處理不能有效降低體內炎性細胞因子含量，而rAAV9-HIF-1α+缺血后處理可以明顯降低體內炎性細胞因子含量，通過抑制炎性反應的發生，減輕肺損傷(表1)。

表1 db/db小鼠各組炎性細胞因子含量

4.氧自由基含量：與S組比較，I/R組的MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與I/R組比較，IPostC組和HIPostC組的MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05)；與S組和IPostC組比較，HIPostC組的MDA含量明顯降低(P<0.05)；脂質代謝產物MDA可反映氧自由基生成量，而氧自由基清除劑SOD可反映機體清除氧自由基的能力，MDA含量明顯升高而SOD活性降低，則提示缺血/再灌注損傷致急性肺損傷時體內氧自由基含量顯著升高，缺血后處理可以減少ROS的生成，而尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后缺血后處理可以使ROS的生成更進一步減少，從而發揮肺保護作用(表2)。

表2 db/db小鼠各組氧化應激因子含量

討 論

急性肺損傷以炎性反應失衡和血管通透性增加為主要病理特征，臨床表現為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥等[8]。研究發現，心肌缺血/再灌注損傷時心肌氧供不足，通過氧化應激和炎性反應釋放大量氧自由基和炎性細胞因子游走于全身，并作用于鄰近器官肺[9]。而此時炎性細胞因子與肺部效應細胞共同參與，進一步發生級聯放大的炎癥繼發性損傷，引起多種炎性細胞因子與氧自由基的積聚，造成炎性介質的泛濫，肺內促炎性細胞因子與抗炎性細胞因子失衡，導致肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，進而造成彌漫性肺間質及肺泡水腫[10～12]。

本研究病理結果顯示，I/R組肺組織損傷程度明顯增加，出現肺泡及間質水腫、肺毛細血管擴張及中性粒細胞浸潤，表現為肺泡壁嚴重受損出血和斷裂情況嚴重，較多的急、慢性炎性細胞浸潤，胞質深染，部分肺泡萎縮提示心肌缺血/再灌注后肺組織損傷嚴重，心肌缺血/再灌注損傷后急性肺損傷模型成功建立。此外，I/R組中促炎性細胞因子增多而抗炎性細胞因子減少，氧自由基含量增多，進一步證實了糖尿病心肌缺血/再灌注致急性肺損傷機制與炎性反應和氧化應激相關。

低氧誘導因子HIF是在缺血缺氧狀態下被激活的一種轉錄因子，可以通過調節下游多種靶基因，參與血管生成、葡萄糖代謝及氧運輸等多種途徑的轉錄調控，從而發揮肺保護作用[13]。McClendon等[14]研究發現HIF可作用于肺部，修復損傷的肺泡上皮細胞，使肺組織耐受缺氧狀態，抑制氧自由基的積聚，減輕肺部炎性反應從而發揮肺保護作用。此外HIF-1α激活能夠降低肺氧耗量，維持氧供需平衡，修復已受損的肺泡毛細血管，發揮肺保護作用。然而，在筆者前期研究中也發現，糖尿病狀態下HIF信號通路處于失活狀態，心肌缺血/再灌注損傷更加嚴重，因此本研究使用尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α的方法，外源性提高HIF-1α，恢復HIF-1α活性，探討糖尿病狀態下缺血后處理是否具有肺保護作用[5,15]。

本研究結果顯示，糖尿病小鼠中IPostC組只能輕微緩解肺損傷程度，肺泡壁周圍仍有出血和大量炎性細胞浸潤；而與IPostC組比較，HIPostC組肺泡壁水腫、斷裂及出血情況均顯著減輕，細胞壁結構基本恢復完整；提示糖尿病狀態下rAAV9-HIF-1α+缺血后處理這一措施，對于心肌缺血/再灌注后受損的肺組織具有一定程度的保護作用。

此外，尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后HIPostC組中的HIF-α含量顯著增高，促炎性細胞因子IL-6、TNF-α減少，抗炎性細胞因子IL-10相對增多，達到炎性細胞因子相對平衡的狀態，從而發揮肺保護作用。與此同時，HIPostC組過氧化脂質降解產物MDA的含量減少，氧自由基清除劑SOD的活性提高，提示氧自由基的含量明顯減少。由此筆者考慮缺血后處理發揮肺保護作用與激活HIF信號通路，減輕肺部炎性反應，修復受損的肺泡毛細血管，改善血管通透性有關；糖尿病狀態下HIF信號通路弱化，但若外源性提高體內HIF-1α的含量恢復其活性，缺血后處理可在一定程度上恢復肺保護作用。

綜上所述，尾靜脈注射rAAV9-HIF-1α后缺血后處理可減輕心肌缺血/再灌注所致的急性肺損傷，其發揮作用可能與調控促炎性細胞因子與抗炎性細胞因子的平衡，抑制氧化應激，激活HIF信號通路相關。