負載二甲雙胍骨組織工程支架的制備及評價

戴桓琰 孫一丹 鄭劍瑩 費 凡 韓 冰

大段骨缺損的治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究難點，作為骨缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，自體骨具有優(yōu)越的骨誘導(dǎo)性能，但因手術(shù)創(chuàng)傷大、自體骨骨量有限，其在臨床應(yīng)用中仍有一定局限性，為此研究人員一直在尋找自體骨的替代品。組織工程支架骨可模擬骨細胞外基質(zhì)微環(huán)境，是最具潛力及應(yīng)用前景的新型骨修復(fù)材料[1]。聚乙烯醇(poly vinyl alcohol，PVA)是一種生物相容性良好的人工合成高分子材料，具有可調(diào)節(jié)的親水性和較高的黏彈性，但由于缺乏細胞識別位點，PVA的細胞黏附性較差，因而常通過添加β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)等生物活性顆粒來提高材料與骨鍵合的能力[2～4]。然而與自體骨比較，PVA/β-TCP復(fù)合支架的骨誘導(dǎo)能力有限，因此將成骨誘導(dǎo)性物質(zhì)與支架材料結(jié)合是提高支架骨再生能力的關(guān)鍵[5]。

葡萄糖與骨代謝之間關(guān)系密切，二甲雙胍(metformin，MET)作為治療2型糖尿病的首選降糖藥，可以降低糖尿病患者的骨折風(fēng)險[6,7]?，F(xiàn)有研究顯示，二甲雙胍可以誘導(dǎo)小鼠前成骨細胞(MC3T3-E1)、人絨毛膜間充質(zhì)干細胞、誘導(dǎo)性多能干細胞成骨分化[8～10]。因此，本研究擬利用低溫3D打印技術(shù)設(shè)計出一種負載二甲雙胍的PVA/β-TCP功能支架，通過對支架進行一般性能表征、藥物釋放檢測、體外細胞相容性檢測，初步探討其作為人工骨的潛能。

材料與方法

1.材料、主要試劑和儀器：β-TCP、PVA和二甲雙胍(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，H-DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。3D打印機(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所)，掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2.支架的制備：將4g PVA加到46ml去離子水中，120℃水浴加熱4h以制備8%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PVA溶液；待冷卻后加入一定量的二甲雙胍，超聲分散并用玻璃棒攪拌20min，使藥物顆粒均勻分布；稱取與PVA等質(zhì)量的β-TCP，過篩后與上述溶液混合，攪拌機繼續(xù)攪拌1h至漿料均勻；打印機工作臺為15～18℃，根據(jù)預(yù)設(shè)的打印程序進行支架的3D打??；將3D打印機支架置于通風(fēng)櫥干燥24h。根據(jù)上述步驟共制備兩組支架：PT支架(PVA/β-TCP復(fù)合支架)、PTM支架(PVA/β-TCP/二甲雙胍復(fù)合支架，二甲雙胍載藥量為占干燥后支架質(zhì)量的1%)。各組支架經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌備用。

3.支架表面形態(tài)觀察：在干燥的支架表面噴金固定后，通過掃描電子顯微鏡觀察支架表面微觀結(jié)構(gòu)。加速電壓為3.0kV。

4.支架孔隙相關(guān)測量：使用Nano Measurer1.2對支架的顯微鏡下圖片進行孔徑測量；通過液體置換法對支架孔隙率進行測量。取干燥支架，稱質(zhì)量為Ws；將乙醇完全填充比重瓶，稱質(zhì)量為W1；將干燥支架浸入乙醇中，超聲除氣，待乙醇充分充滿支架孔隙后，再向比重瓶中加滿乙醇，稱質(zhì)量為W2；取出支架，稱剩余乙醇和比重瓶質(zhì)量為W3；當(dāng)前室溫下乙醇密度為ρe?？紫堵?Φ，%)=(W2-W3-Ws)/ρe/(W1-W3)/ρe×100%。

5.支架吸水率的測定：稱重干燥支架質(zhì)量為 W1，室溫下將支架浸于去離子水中，24h后取出并用濾紙吸去材料表面的水分，稱質(zhì)量為W2。支架的吸水率(X，%)=(W2-W1)/W1×100%。

6.支架的藥物緩釋能力：取0.7g的PTM支架分別置于加入2ml中性PBS溶液的離心管中，離心管放于37℃，150r/min的恒溫震蕩箱中孵育；定期收集1ml PBS溶液并用新鮮PBS補足至原有體積，酶標(biāo)儀檢測233nm波長處待測液的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照二甲雙胍標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線的方程式，計算各待測液中二甲雙胍含量，定量計算支架14天內(nèi)藥物總釋放率。釋放率(DR,%)=總藥物釋放量/支架中的總藥物量×100%。

7.支架的細胞毒性測試：以0.1g/ml比例將滅菌支架浸于增殖培養(yǎng)基中并放入37℃，5% CO2敷箱，24h后收集支架浸提液，并于4℃密封儲存。以1×104個/孔的細胞密度將MC3T3-E1接種至96孔培養(yǎng)板，使用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，待細胞長滿孔底95%以上，將培養(yǎng)介質(zhì)更換為支架浸提液(PT支架、PTM支架)或新鮮增殖培養(yǎng)基(Ctrl)，建立空白組，敷箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。按照CCK-8試劑盒說明，酶標(biāo)儀檢測450nm波長處待測液的吸光度(A)值。細胞生存率(CV，%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

8.支架的細胞黏附測試：將滅菌支架放置于24孔板中，以5×104個/孔的細胞密度將MC3T3-E1接種至支架表面，置入37℃，5% CO2恒溫敷箱孵育。24h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，使用DAPI溶液對支架上的細胞進行熒光染色。激發(fā)波長360～400nm，避光，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

9.支架的細胞增殖測試：將滅菌支架放置于96孔板中，以2000個/孔的細胞密度將MC3T3-E1接種至支架表面，置入37℃，5% CO2恒溫敷箱孵育。隔天換液。分別于培養(yǎng)1、3、5天時檢測細胞的增殖活性。按照CCK-8試劑盒說明，酶標(biāo)儀檢測450nm波長處待測液的吸光度值。以A值間接比較細胞增殖程度。

結(jié) 果

1.支架的宏觀結(jié)構(gòu)：3D打印的PTM支架呈白色的立方多孔結(jié)構(gòu), 支架的孔徑規(guī)則且一致，具有相互連通的孔隙。通過3D打印技術(shù)可制備大小不等的支架，以針對不同需求(圖1)。

圖1 PTM支架

2.支架表面超微形態(tài)：通過掃描電鏡觀察，在放大40倍下，可見PT與PTM支架具有相互連通的孔隙結(jié)構(gòu)，孔徑大小均一；在放大500倍下，可見支架表面均具有微米級的孔隙結(jié)構(gòu)，PTM支架表面粗糙程度略有增加；在放大5000倍下觀察，PTM支架表面可見摻入的二甲雙胍顆粒(圖2)。

圖2 兩種支架掃描電鏡照片

3.支架的孔徑、孔隙率：PT、PTM支架的孔徑分別為518.30±13.96mm和516.40±36.86mm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PT、PTM支架的孔隙率分別為66.59%±0.87%和67.22%±1.30%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4.支架的吸水率：PT支架的吸水率為35.00%±0.54%，PTM支架的吸水率為53.78%±0.73%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

5.二甲雙胍的緩釋結(jié)果：二甲雙胍在前5天出現(xiàn)較快的釋放，隨后進入緩慢的釋放階段，至14天時釋放率為74.03%±9.34%(圖3)。

圖3 14天內(nèi)二甲雙胍的體外釋放曲線

6.支架的細胞毒性測試：兩種支架的細胞生存率均大于90%，與陽性對照組(Ctrl組)比較沒有明顯的毒性效應(yīng)，證明支架的毒性較小，不影響細胞的正常活動(圖4)。

圖4 兩種支架的細胞毒性

7.支架的細胞黏附測試：細胞在支架上培養(yǎng)24h后，兩種支架均表現(xiàn)出良好的細胞附著力和擴散力。與PT比較，PTM上的細胞鋪展面積更大，由圓形變?yōu)榘鍫钇戒伣Y(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 兩種支架細胞黏附的免疫熒光染色圖

8.支架的細胞增殖測試：隨著時間的增加，細胞在支架上的增殖活性隨之增長。在1～3天，兩種支架的增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)培養(yǎng)5天時，PTM支架上細胞的增殖活性明顯增加，與PT支架比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

圖6 兩種支架的細胞增殖活性

討 論

骨組織具有一定的自我修復(fù)能力，經(jīng)過復(fù)雜的骨改建與重塑過程后可愈合而不留瘢痕；但當(dāng)缺損達到臨界范圍時，骨失去再生能力，可導(dǎo)致炎癥、骨不連和畸形等，嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量[11]。臨界骨缺損無法自我修復(fù)的原因為：①間充質(zhì)干細胞向缺損部位遷移不足；②骨祖細胞數(shù)量不足；③骨祖細胞無法完全分化為成骨細胞[12]。二甲雙胍作為抗高血糖的小分子藥物，可激活A(yù)MP激活蛋白激酶信號通路，并上調(diào)骨祖細胞中核結(jié)合因子α1和脂蛋白相關(guān)蛋白5的表達，誘導(dǎo)向其成骨細胞方向分化[13]。為避免小分子藥物在體液環(huán)境中突釋，對組織產(chǎn)生細胞毒作用，選擇合適的遞送系統(tǒng)可保證其穩(wěn)定、持續(xù)的釋放[14]。PVA作為親水的高分子材料，已用于攜帶和維持生物活性分子的釋放，β-TCP因具有優(yōu)于HA的骨傳導(dǎo)性和降解性，在骨再生領(lǐng)域亦得到廣泛應(yīng)用[15,16]。

新興的3D打印技術(shù)克服了傳統(tǒng)制造技術(shù)的局限性，可設(shè)計出滿足臨床個性化需求的人工骨。本實驗選用低溫3D打印的PVA/β-TCP復(fù)合支架作為遞送二甲雙胍的骨傳導(dǎo)載體，既可保證支架結(jié)構(gòu)的精確性，亦可避免打印過程中的高溫環(huán)境影響藥物的生物活性，使其始終保持誘導(dǎo)新生組織的性能，進而保證PTM復(fù)合支架可實現(xiàn)藥物控緩釋的作用效果。相較之下，Chen等[3]采用熔融沉積成型技術(shù)制備支架，打印過程中175℃的高溫會破壞骨誘導(dǎo)活性因子的生物活性。

支架結(jié)構(gòu)是影響支架成骨活性的重要因素。在本實驗中，二甲雙胍的摻入對支架的三維多孔結(jié)構(gòu)影響很小，PTM支架的孔徑均一、形態(tài)規(guī)則且連通性良好，500μm的大孔有利于引導(dǎo)新生骨、血管向支架內(nèi)部生長[17]。兩種支架的孔隙率全部高于60%，滿足人體松質(zhì)的要求，為細胞遷移和營養(yǎng)物質(zhì)運輸提供了良好的組織結(jié)構(gòu)[18]。

理想的骨組織工程支架微環(huán)境應(yīng)促進周圍組織的成骨礦化和血管生成。本實驗通過向PVA溶液中摻入二甲雙胍顆粒，使其均勻分布于所有的PTM支架中。結(jié)合掃描電鏡進一步觀察，支架表面可見微米級孔隙，裸露的二甲雙胍顆粒無疑增加了支架表面的粗糙度。目前研究認(rèn)為，微米級粗糙度有利于促進成骨細胞合成并分泌前列腺素E2和轉(zhuǎn)化生長因子-β1，以創(chuàng)造利于成骨的微環(huán)境，也可為細胞黏附提供錨固點[19]。潤濕性是細胞黏附與增殖的關(guān)鍵因素之一，與疏水性材料比較，親水性材料具有更強的細胞親和力[20]。PTM支架的吸水率較PT支架的明顯提高，這表明支架中摻入的二甲雙胍發(fā)揮了良好的親水作用。良好的生物相容性是支架成骨的關(guān)鍵。支架細胞毒性檢測顯示，PTM支架的細胞生存率>90%，毒性不良反應(yīng)很小，摻入的二甲雙胍不影響細胞的正?；顒?。通過DAPI熒光染色觀察也可進一步證實支架良好的細胞附著力和擴散力。

根據(jù)二甲雙胍的緩釋結(jié)果分析，PTM支架表面裸露的二甲雙胍最先溶解，在前期經(jīng)過一個快速釋放階段后，從第5天開始，隨著PVA與β-TCP逐漸降解，包埋在支架內(nèi)部的二甲雙胍得以緩慢釋放，至14天時藥物累積釋放約74%。這些結(jié)果表明，PTM支架可以達到持續(xù)緩慢釋放二甲雙胍的效果，這可對骨祖細胞提供一個長時間的刺激，從而加速成骨和成血管過程[21]。結(jié)果顯示，將細胞與支架共培養(yǎng)1、3、5天，細胞的增殖活性逐步提高，尤其是第5天時，PTM支架的細胞增殖明顯高于PT支架。

綜上所述，通過低溫3D打印制備的PTM支架具有互連良好的三維多孔結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的生物相容性，二甲雙胍的摻入提高了支架表面粗糙度和親水性，為細胞黏附提供了錨固點，細胞在支架上黏附良好，隨著藥物的逐步緩釋，提高了細胞的增殖能力。支架體內(nèi)成骨的研究正在進行中，此研究在骨再生領(lǐng)域具有廣闊的前景。